4 个步骤获得更好的 ChIP 结果——第 2 步：精确制备

本系列的第 1 部分描述了在你的实验步骤中加入适当对照的重要性。现在，我们将讨论染色质制备会如何影响最终实验结果。

首先考虑你要检测的相互作用类型：

• 高频率、非常稳定的蛋白与 DNA 之间的相互作用（如组蛋白与 DNA 之间的相互作用）发生频率高，即使实验步骤未经完全优化也能检测到。
• 如果实验步骤不能确保蛋白和 DNA 的完整性，或如果使用了对目的靶标不具有高度特异性的抗体，则低频率且较不稳定的相互作用（比如多梳蛋白家族与特定基因 [例如 Ezh2] 的结合）就可能会低于检测阈值。

现在，是时候考虑你制备染色质的方案了... ...

第 2 步：染色质制备 -

许多实验室主要使用超声处理来制备他们用于免疫沉淀的染色质。虽然有效果，但超声处理需要将染色质暴露在苛刻的变性条件（即高热和去垢剂）下，这些条件可能会同时破坏抗体表位和基因组 DNA。此外，超声处理有不一致性。制备方法和质量将根据你所使用的超声仪的类型和品牌，以及所使用的超声仪探头的状况而有所变化。此外，染色质处理不足与处理过度之间可能只有数秒差异。因此，使用这种方法难以生成片段大小一致的染色质。

相比之下，酶消化法使用微球菌核酸酶切割核小体之间的连接区域，以柔和地把染色质碎裂成一些均匀的片段。酶消化无需高热条件或去垢剂，如果使用建议的酶/细胞数量比例，便可得到一致的结果。因此，酶消化易于控制，可避免抗体表位和 DNA 被剪切或出现变性，并得到有利于进行免疫沉淀的一致、高品质的染色质。

使用 SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 和另一家公司的超声处理试剂盒进行以下所示的实验。首先采用酶消化（依照 SimpleChIP 试剂盒说明）或超声处理（依照其他公司的说明）来制备染色质。根据所示的一组抗体，使用 SimpleChIP^® 试剂盒或其他公司的试剂盒中的免疫沉淀试剂对染色质进行免疫沉淀。通过实时 PCR 对免疫沉淀的 DNA 进行定量，以占总输入染色质的百分比表示。

使用其他公司的免疫沉淀试剂盒或 SimpleChIP^® 试剂盒时，经酶消化的染色质上的靶标 DNA 位点富集度均强于经超声处理的染色质。在相互作用较为不稳定时，这一点尤其明显，例如检测到多梳亚家族蛋白（Ezh2 [D] 或 SUZ12 [E]]）结合特定基因。

第 3 步：免疫沉淀 - 让 DNA 沉淀……点击此处查看……

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这是关于如何改进 ChIP 实验步骤的四部分系列文章中的第二篇。这些帖子改编自我们完整的《成功进行染色质免疫沉淀的指南》，你可以点击下面的按钮来下载。