这是有关如何优化免疫组织化学 (IHC) 实验步骤的两部分系列内容的第二部分。第一部分介绍了抗原修复背后的原理……但是，如果您已经准备好组织并准备开始，我们将继续进行染色实验步骤的后续步骤。
好的 IHC（免疫组织化学）实验方法可以为特异性识别和结合的提供适宜条件。因此，应针对您正尽力检测的抗原-表位特异性相互作用校准抗体稀释剂的离子强度和 pH，这必不可少。TBST（137 mM NaCl、20 mM Tris、0.1% Tween-20；pH 7.6）常用于此目的。它与生理盐水为等渗压，且在生理 pH 值 为 7.2-7.6 左右时有缓冲作用。这些条件模拟在免疫系统相互作用的自然过程期间抗体和抗原遭遇的环境。
作为结果，TBST 配合许多抗体良好发挥作用……但并非所有抗体。例如，PLK1 (208G4) Rabbit mAb 稀释于 TBST 时产生有限信号，但我们在 SignalStain® Antibody Diluent (CST #8112)（图 B）中稀释这种抗体时，信号改善。
其他一些获专利的稀释剂可在市场上买到，并且每种稀释剂由含有缓冲组分、去垢剂和/或蛋白稳定剂的不同混合物组成。在这种情况，相比 TBST，获专利的抗体稀释混合剂支持 PLK1 (208G4) 与其表位之间的相互作用。每种市场上能买到的稀释混合剂都获得了专利，因此研究人员需要逐一确定每种混合剂的适用性。
检测试剂会通过二抗中间物直接或间接结合一抗，从而将酶（通常是辣根过氧化物酶 (HRP)）运送到特定表位位点。加入 HRP 显色底物时，形成的沉淀物会沉积在一抗/抗原结合事件发生的位点，这通过显微镜检查便可观察到。
通常，生物素和链霉亲和素会促进这种相互作用：二抗偶联于可结合链霉亲和素的生物素，而链霉亲和素分子本身偶联于 HRP。这种方法有一些限制。
首先，链霉亲和素-HRP 复合体能结合内源性生物素，并产生明显的背景信号。如果使用 HIER（见第 1 步），内源性生物素的问题就更加严重了，因为隐藏的生物素会沿着其他表位显示。其次，显色信号的强度取决于存在的酶的数量（即酶越多，信号越强），但结合一抗/抗原相互作用位点的 HRP 分子的数量则受限于结合复合体的链霉亲和素分子的数量。
聚合物系统很受欢迎，因为它们能避免生物素系统的限制。在这种方法中，葡聚糖等聚合物能同时偶联二抗和 HRP 酶。聚合物主链可以无需在一抗/抗原位点形成生物素-链霉亲和素-HRP 复合体，从而避免可能的生物素背景噪音。另外，相对于链霉亲和素系统，可以结合的 HRP 分子的数量更多，因此更少的一抗/抗原结合位点可以相应产生更多的信号，从而增加了检测的敏感性。
当我们使用生物素检测系统来评估 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体时，我们发现它无法产生足够强的信号，即使我们已经更换了其他配套试剂也是如此。因此，我们转而使用更加敏感的聚合物检测方法。尽管信号明显增长（图 C），但这不足以满足我们的标准。
但我们还有更多方法……
DAB（3,3'-二氨基联苯胺）、AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）或 Vector NovaRED 等色原是与结合至检测试剂的 HRP 相互作用的底物。有几种显色底物可以使用，它们能产生各种颜色，颜色强度也不同。在设计你的实验时，选择的色原所产生的颜色要能与你的复染色形成适当对比度，而且其强度足以显示你尝试检测的抗原。
最初，我们以 Vector NovaRED (Vector Laboratories) 作为色原测试 PLK1 (208G4) Rabbit mAb，这种色原产生一种亮红色沉淀物。但 NovaRED 不能产生足够强的信号，因此我们转而使用强度更高的深褐色 DAB。以 DAB 底物联合专用稀释剂和检测系统实现的信号足够稳健（图 D），从而我们最终能够建议 PLK1 (208G4) Rabbit mAb配合包含专用配套试剂的指定实验步骤用于 IHC。