一张图胜过千言万语，或者在免疫荧光(IF) 成像情况下，一张图胜过一千种蛋白质。用于描述科学实验的图像所传达的信息量应不逊于文本。在 CST，我们的抗体质量和严格的验证流程让我们深感自豪。当我们批准将一抗用于免疫荧光实验时，我们会使用内部生成的高品质成像展示它们。除了我们建议的免疫荧光实验步骤之外，这里还有一些在规划免疫荧光染色时需要考虑的额外因素。
第 1 步：细胞健康
你使用的细胞的健康状态会反映在你的免疫荧光图像中。周末被遗忘在孵育箱中的平板上的细胞可能会产生多核及应激颗粒，出现污染或死细胞碎片（见下文）。
第 2 步：融合度
有时，我们想要关注高度融合的细胞培养物的信号转导，比如使用 ZO-2（如 ZO-2 Antibody #2847）进行紧密连接染色。但如果细胞过度汇合，又没有任何明确边缘，您的图像中可能丢失背景。另一方面，如果细胞过于稀疏，则待成像的视场选择就会受到限制。
使用 ZO-2 Antibody #2847（绿色）对 A431 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5™（荧光 DNA 染料）。
第 3 步：一抗选择
使用经严格验证的抗体可使成像流程更加顺利。如果在生成最终图像前已完成所有验证工作（滴定、实验步骤优化），即可获得最佳结果。高内涵分析软件所生成的灰度图像用于按图版格式比较抗体强度（左图）。单色或双色图像足以用来确定最佳工作稀释度（中图）。这些早期分析可确保最终的三色图像最能再现目的靶标（右图）。
使用 RAIG1 (D4S7D) XP Rabbit mAb #12968（绿色）对 MKN-45 细胞（上方远处图）和 293T 细胞（右下图）进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 DyLight 554 Phalloidin #13054 标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。
第 4 步：二抗和复染剂
在 CST，我们通常使用 Alexa Fluor 488 偶联二抗（或一种直接偶联于 Alexa Fluor 488 的抗体）检测目的靶标，因为它的绿色荧光非常醒目。此外，还应选择复染剂和 DNA 染料来帮助凸显抗体染色并提供背景，但不应掩蔽目的染色
步骤 5：视场和变焦
如果可能，选择展示抗体性能的细胞数目中等（我们的目标是多于 3个）的事业 — 如果染色更不均一，则请确保挑选一个展示这点的视野。如果过度缩小，那么你可能无法表现具体的亚细胞定位（如有丝分裂或黏着斑）。
跟任何技术一样，熟能生巧。你掌握的荧光染色实验越多，操作就越自如，你获得的图像质量也会越好。即使是要查遍一个孔中的每个视场才能获得你想要的结果，也值得付出努力。祝你好运，愿你总能看到荧光团！
有兴趣进一步了解一个好的免疫荧光实验方案如何帮助你推进研究？观看以下视频，更多了解使用荧光成像和流式细胞测定法优化细胞信号转导事件分析：
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