利用全流程加标对照实现 CUT&RUN 与 CUT&Tag 的可靠数据标准化

如果您使用 CUT&RUN 或 CUT&Tag 技术来绘制组蛋白修饰、DNA 甲基化、转录因子结合或辅因子在全基因组范围内的分布图谱，那么您的最终目标便是检测并识别基因表达中真实的生物学变化。当然，您需要确保所检测到的任何变化并非源于细胞投入量、样本处理方式或测序深度的差异。然而，标准化对照的应用在过去一直缺乏一致性，甚至常常被省略，这使得即使是最有前景的数据集，也可能在不知不觉中受到工作流程变异性的影响，而非真实反映生物学变化。

“染色质分析素以技术要求严苛而著称，其中一大挑战在于，相关检测往往偏重定性而非定量。”CST 表观遗传检测副总监 Fang Chen 博士解释道，“科研人员正在寻找一种简便的标准化解决方案，以揭示影响实验结果的因素。加标对照易于实施，而且能增强您对所解读数据的信心。”

本文探讨了加标对照（尤其是全流程果蝇加标对照）如何助力研究人员轻松将标准化整合到 CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验中，从而生成可信赖的染色质数据。

染色质分析中的标准化缺失

尽管文献中已讨论多年，加标对照标准化在染色质检测中的应用仍显不足，部分原因在于一直缺乏适用于常规工作流程的实用、即用型加标对照方案。^1-3

“若缺乏合适的对照，标准的测序深度标准化可能会掩盖全局变化或放大技术变异，”Chen 解释道，“过去，许多染色质检测常常忽略对照，因为内部制备加标对照材料在技术上复杂且耗时，很少有实验室具备这样的条件。这可能导致数据集看起来干净，却悄然歪曲了潜在的生物学真相。”

因此，科研人员可能会面临以下三个常见的痛点：

• 不确定所观察到的组间差异究竟是反映真实的生物学变化，还是仅仅源于细胞投入量、样本处理或测序深度上的差异。
• 担心数据集的噪音大或不可重复，却不知问题出在何处，从而可能阻碍项目进展或削弱发表文章的说服力。
• 忧虑标准化可能需要高级统计学知识或实验室内部自行制备的定制试剂，这对许多实验室而言遥不可及。

拥有明确的标准化策略有助于缓解这些挑战，它通过提供一个基准，使研究者能够自信地比较针对同一靶标蛋白的不同样本之间的信号，从而确保观察到的变化反映真实的生物学信号，而非工作流程中的噪音。

标准化对照的类型：酵母菌和大肠杆菌 DNA 对比果蝇细胞核

多数科研人员对基于酵母基因组 DNA 的 DNA 加标对照已较为熟悉。在 CUT&RUN 检测中，片段化的酵母 DNA 可在染色质消化后加入，为 DNA 纯化、下游 qPCR 及下一代测序分析 (NGS) 提供样本标准化依据。在某些 CUT&RUN 和 CUT&Tag 工作流程中，源自 MNase 或 Tn5 制备过程的残留大肠杆菌 DNA 也可作为一种实际上的对照：它能反映酶反应的变化，但与酵母 DNA 一样，无法校正细胞投入量或早期洗涤步骤的差异，而且不同批次酶中大肠杆菌 DNA 的含量存在差异，使其难以用于一致的质控。

“当主要关注点在于工作流程后期阶段的变异时，传统的 DNA 加标对照标准化是一种有用的策略，”Chen 指出，“然而，酵母和大肠杆菌 DNA 无法校正起始细胞数量或早期处理步骤的差异，并且酵母 DNA 加标对照与 CUT&Tag 技术不兼容。”

一种较新的方法是在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 工作流程的最开始引入果蝇加标细胞核，使其在细胞通透前直接与实验细胞混合（图 1）。在抗体孵育步骤中，除了加入针对目标靶点的抗体外，还同时加入一种果蝇 H2Av 单克隆抗体。该抗体能持续、特异性地标记果蝇组蛋白，从而在所有样本中产生一个参考信号。随后，该信号可用于生成标准化因子，并将其应用于实验样本基因组，以校正整个工作流程中的技术变异。

图 1.CUT&RUN 和 CUT&Tag 检测的实验流程，图中标注了果蝇加标细胞核及 H2Av 单克隆抗体整合至实验中的具体环节。加入果蝇加标对照可为整个检测流程提供标准化覆盖。

由于果蝇细胞核与实验样本一同经历固定、膜通透、抗体结合、靶向消化或标签化、DNA 纯化、文库制备及测序等步骤，因此它们充当了真正意义上的全流程标准化对照。

在实验开始前，需预先决定采用哪种加标对照——下游的酵母 DNA 加标对照与果蝇加标对照在功能上是冗余的，因此同一实验中无需同时使用两种对照。

表 1. 酵母加标对照与果蝇加标对照的比较。需要注意的是，作为 MNase 或 Tn5 生产过程中残留的大肠杆菌 DNA，其并未作为 CST 产品提供。 

“你需要根据你所探究的科学问题来选择最适合的对照，”Chen 解释道，“酵母 DNA 加标对照可为 CUT&RUN 检测中文库水平的变异性提供有价值的信息，而果蝇加标对照则适用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag 两种技术，并将标准化的覆盖范围扩展至流程早期、容易出错的步骤。”

对于某些特定类型的 CUT&RUN 实验，选择酵母 DNA 加标对照仍然是可靠且足够的选择，例如：

• 简单的基准测试和实验体系建立，此时主要关注点在于文库制备和测序深度。
• 聚焦于全基因组整体结合模式而非细微全基因组变化的预试验。
• 起始材料和样本处理已严格标准化的情形（例如，在受控条件下培养的特征明确的细胞系）。

相比之下，在以下情况下，建议采用全流程加标对照，因为它能提供额外的保障，确保获得可信赖、具有生物学相关性的数据：

• 需要对 CUT&Tag 检测进行可靠标准化时。
• 药物扰动研究（例如 EZH2 抑制剂），在此类研究中，组蛋白标记的全局变化是预期结果，且必须与技术变异性区分开来。
• 在密切相关的条件之间比较细微的染色质变化，例如时间序列实验。
• 长期研究、需要重复分析样本的研究，或分析多个样本的研究，此类研究中日常处理操作的差异难以避免。
  
• 处理可变起始材料时，例如来源于患者的细胞、原代组织或低投入量样本，这些样本的起始质量波动可能更大。

果蝇加标对照对实验的意义

从仅覆盖后期阶段的酵母 DNA 加标对照转向覆盖全流程的果蝇加标对照，将标准化的覆盖范围从检测流程的一部分扩展至每一个实验步骤。

这在药物作用机制研究和低投入量样本滴定实验中尤为重要，如下文实例所示，这些实验必须将细微的或全局的染色质变化与技术变异性区分开来。

采用标准化的药物处理验证示例

在针对染色质调控因子的药物扰动研究中，如果标准化仅依赖于测序深度，像 H3K27me3 这样的组蛋白标记的全局变化很容易被高估。下图所示的 CUT&RUN 实验展示了这种情况在实际数据中的体现。

在该实验中，100,000 个 MCF7 细胞经 EZH2 抑制剂（如他泽司他）处理后，与未经处理的细胞进行比较（图 2）。在该工作流程中，果蝇加标细胞核在第一步即被固定在 Concanavalin A 包被的磁珠上，并与实验样本一同经历通透、抗体孵育、pAG-MNase 结合及相关的洗涤步骤，以及文库制备和测序。

图 2. 利用果蝇加标对照标准化进行药物处理验证。使用 100,000 个 MCF7 细胞进行 CUT&RUN 实验，分别给予或不给予 1 μM 他泽司他处理 6 天（如图所示），并使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 或 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 进行检测。DNA 文库使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备。图中展示了 HOXD 基因簇和 ACTB 基因的结合情况，这两个基因分别是 H3K27me3 和 H3K4me3 的已知靶标。在使用 CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 中的果蝇加标对照进行标准化后，经 EZH2 抑制剂处理的样本中 H3K27me3 信号显著降低，这与 H3K27me3 水平的下降相一致。相比之下，H3K4me3 信号保持相当的水平，因为该药物不影响 H3K4me3。

“应用果蝇加标对照标准化后，药物处理的样本显示出由 EZH2 抑制所导致的 H3K27me3 基因组结合减少的预期变化，”Chen 解释道，“这种模式正是科学家期望看到的，因为它与蛋白质印迹实验中药物处理后 H3K27me3 水平降低的结果相一致。”

对 CUT&RUN 数据的额外正交验证（图 3）表明，他泽司他处理后 H3K27me3 信号的减少，与蛋白质印迹分析中 EZH2 和 H3K27me3 蛋白水平的降低相一致。图 3. 使用指定浓度的他泽司他处理 MCF7 细胞 1、3 或 6 天后，采用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit Monoclonal Antibody #9733 和 Ezh2 (D2C9) Rabbit Monoclonal Antibody #5246 进行蛋白质印迹分析。经 EZH2 抑制剂他泽司他处理 6 天后，H3K27me3 和 EZH2 水平均出现下降。

受药物影响的 H3K27me3 标记呈现出预期的下降，而不受影响的活性标记 H3K4me3 则保持不变，这进一步增强了人们的信心，确信所观察到的变化属于生物学效应，而非样本处理或测序深度所导致的副作用。若缺乏合适的加标对照标准化，H3K27me3 的全局变化可能会被常规的测序深度标准化部分或完全掩盖，导致对药物效应的低估或误判。

确保细胞梯度滴定实验中的信号准确标准化

当实验挑战细胞投入量的极限时，例如将细胞数量从 200,000 个梯度降至 20,000 个以测试检测灵敏度，标准化也变得至关重要。在这样的梯度滴定实验中，果蝇加标对照标准化使得 MYC 基因等位点上的 CTCF 信号与起始细胞数量呈强正相关的近线性关系，即使在投入量变得有限时也是如此（图 4）。

图 4. 全流程标准化保持了起始细胞数量与 MYC 位点信号之间的强相关性。使用 200,000、100,000、50,000 或 25,000 个 HeLa 细胞（如所示）和 CTCF (D1A7) Rabbit Monoclonal Antibody #3417，利用 CUT&Tag Assay Kit #77552 和 Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811 进行 CUT&Tag 实验。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。图中展示了 CTCF 已知靶标基因 MYC 上的结合情况。标准化后，信号强度与起始细胞数量呈正相关。

对于研究人员而言，这既是一个概念验证，也是一种实用的质量控制措施：该检测方法真实地反映了投入量的实际差异，而任何偏离预期的细胞数量与信号之间关系的情况，都可以归因于技术因素，而非内在的生物学变异性。这在疾病建模情境中尤为重要，因为来源于患者的样本可能仅能以较低的细胞数量获得。

如果“过度校正”了生物学效应怎么办？

人们自然会担心，如果加标细胞核经历了工作流程中的每一个步骤，那么影响它们的任何技术误差是否会扭曲最终富集计算的结果。毕竟，如果对照和样本都受到了干扰，那对照还能被信任吗？

现代的加标对照标准化策略通过利用在不同条件下从加标对照读段与样本读段之间关系推导出的比值或缩放因子，明确解决了这一问题。当样本和对照受到同等比例的影响时，技术波动会在加标对照信号中显现出来，并能在标准化因子中被校正，而不是隐匿在数据之中。在实践中，只要尽可能保持加标对照/样本比值的一致性并进行恰当分析，加标对照和样本的比例变化就不会自动使生物学结论失效（图 5）。

图 5. 果蝇加标对照标准化不会“过度校正”生物学效应。使用递减数量的 HCT 116 细胞进行 CUT&RUN 实验，并通过 qPCR 定量 Rpb1 CTD 的富集情况。标准化前，由于 DNA 产量降低，qPCR 信号随细胞投入量减少而下降。然而，这并不反映同一细胞模型中 Rpb1 的真实生物学变化。标准化后，除 12.5k 细胞外，不同起始细胞数量下均观察到一致的 Rpb1 结合，而在 12.5k 细胞中，标准化前数据的低信噪比表明存在真正的生物学失败。表明果蝇加标对照标准化能够揭示技术失败，而非人为地增强生物学信号。

“我们已经将果蝇加标对照的投入量校准为真正的内参标准——其丰度足以提供有效信息，同时又特异性针对果蝇基因组，因此不会与您的生物学信号产生竞争，”Chen 解释道，“如果加标对照能反映样本经历的情况，那么当工作流程中的某个环节出现波动时，它就能为你提供指示。”

最后，加标对照模块中的果蝇细胞核数量已经过优化，以确保它们不会在测序深度中占据主导地位。例如，在使用小鼠一抗的检测中，所需果蝇细胞核数量比使用兔一抗时少约 10 倍，因为小鼠抗体在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 检测中通常表现出较弱的活性。类似考虑也适用于某些转录因子和辅因子抗体。果蝇读段占总读段比例的理想范围是 0.5-10%。关于果蝇细胞核适宜数量的指导，在随附的实验方案和疑难问题解答材料中均有直接提供。

实践中的保障措施，例如遵循专用实验方案、保持加标对照比例一致、监测果蝇读段计数，以及在对照信号异常时参考疑难问题解答指南，进一步降低了罕见技术异常导致误导性解读的风险。

降低复杂性，获得可信赖的结果

许多实验室并不将染色质分析作为主要的日常工作流程，但他们的研究假设会引领他们涉足染色质分析，例如，验证药物作用机制、为基因表达建立因果证据，或比较不同时间点的染色质变化。在这些情况下，如何实施和解读标准化对照可能会显得更具挑战性。

无论是覆盖部分工作流程的酵母 DNA 加标对照，还是覆盖全流程的果蝇加标对照，都旨在减轻这种认知负担，使获取可重复、可信赖的 CUT&RUN 和 CUT&Tag 数据变得更加容易。

“这从根本上改变了你解读 CUT&RUN 或 CUT&Tag 数据的信心，”Chen 解释道，“当你在数据中观察到变化时，你就能确信这确实源于生物学因素。”

通过使标准化过程更加规范、透明，研究人员能够专注于生物学问题，同时仍能生成经得起再分析和同行评审的数据。

• 对于 CUT&RUN 工作流程：
  • 果蝇加标对照包含于 CST CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647 中
  • 酵母加标对照包含于 CST CUT&RUN Assay Kit #86652 中
• 对于 CUT&Tag 工作流程，果蝇加标对照以独立模块形式提供，并有适配兔源或鼠源一抗的版本：
  • Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811
  • Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) #19629

Chen 总结道：“我们的目标不是让每个实验室都变成方法学实验室，而是让每个实验室都能获得他们可以信赖的染色质数据。通过酵母或果蝇加标对照实现稳健的标准化，是实现这一目标最直接的途径之一。”

资源

• CST 实验步骤，包括如何添加和分析加标对照：
  • CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) Protocol

  • Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) Protocol

  • Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) Protocol

• 《CUT&RUN 疑难问题解答指南》与《CUT&Tag 疑难问题解答指南》，其中包含有关预期加标对照表现以及当加标对照信号异常时如何应对的章节。
• CUT&RUN 应用概述
• CUT&Tag 应用概述

参考文献

1. Patel LA, Cao Y, Mendenhall EM, Benner C, Goren A. The Wild West of spike-in normalization. Nat Biotechnol. 2024;42(9):1343-1349. doi:10.1038/s41587-024-02377-y

2. Egan B, Yuan CC, Craske ML, et al. An Alternative Approach to ChIP-Seq Normalization Enables Detection of Genome-Wide Changes in Histone H3 Lysine 27 Trimethylation upon EZH2 Inhibition. PLoS One. 2016;11(11):e0166438. Published 2016 Nov 22. doi:10.1371/journal.pone.0166438

3. Taruttis F, Feist M, Schwarzfischer P, et al. External calibration with Drosophila whole-cell spike-ins delivers absolute mRNA fold changes from human RNA-Seq and qPCR data. Biotechniques. 2017;62(2):53-61. Published 2017 Feb 1. doi:10.2144/000114514