近年来，针对肿瘤微环境中的免疫检查点蛋白的研究甚多。如果您从事免疫肿瘤学领域的工作，您很可能正在执行或愿意执行多重免疫组织化学 (mIHC) 分析。最终会生成一张如此处显示的多重图像，其中包含对某种肿瘤的多层次描述，这样的话，每种抗体就会对应一个不同的荧光信号。
如果您想在 IHC 中检测更多靶标，但不确定如何为 mIHC 设计一组抗体和荧光团，我们将在这篇文章中引导您完成整个过程，需特别注意与表位掩蔽相关的抗体顺序。
通过 mIHC 来显示肿瘤细胞让您能够以新的方式检测免疫浸润物，并验证假说。例如，T 细胞是否主要位于肿瘤周围、侵袭性边缘或肿瘤内部？存在的 T 细胞是否表达衰竭标志物？PD-1+/CD8+ T 细胞与 PD-L1+ 巨噬细胞的距离有多近？肿瘤中的 CD8+ T 细胞是否被激活？
像这样的问题对于对 PD-1 阻断的反应率的理解以及将 PD-L1 作为主要生物标记物的趋势而言越来越关键。
设计 mIHC 组合时，要考虑许多因素。以酪胺为基础的多重方法可能是在 FFPE 组织中获得最强信号的最简单方式。如果您有组织、经 IHC 验证的抗体以及酪胺-荧光团偶联物，您就能设置实验步骤。需要考虑的最重要因素之一是每种抗体需要多少，因为与 DAB（3,3'-二氨基联苯胺）等色原相比，使用酪胺检测时通常需要更少的抗体。
一旦您了解每种抗体的染色相对强度，就需要明白获得您最终组合中平衡信号组的最好方式。理想情况下，您会想要搭配使用标签最强和/或靶标表达最富集的抗体与可用性最弱的酪胺-荧光团偶联，并搭配使用染色最浅的抗体与最亮的偶联物。
mIHC 实验步骤涉及多个加热周期，以便在每次染色之间去除（剥离）一抗和二抗。这引入了在将所有谜题拼凑在一起时要考虑的另外一组因素。虽然某些表位在很大程度上不受这种加热的影响，但其他表位对热更敏感，并且会随每次加热而降解，表明信号逐渐减弱。另一方面，其他表位会随着每个额外加热步骤而更加显露，并且随着每个周期的进行而展示出更强的信号。落入这最后一类的表位的抗体最好放在组合中的最后位置。
您还应该考虑一抗剥离的效率。要测试剥离效率，您可以执行常规的染色步骤，包括一抗、二抗、酪胺检测和加热步骤。然后，进行第二轮，这次省略一抗，二抗和酪胺检测步骤相同，但用第二个荧光团取代酪胺偶联物。如下面的示例（左图）所示，该通道中的低染色表示完全剥离。如果您在第二个通道中观察到染色，如下面的 CD4 检测所示（右面板，比较红色通道中的信号），则表明一抗的剥离不完全，您应进一步优化条件以确保一抗完全去除。
使用 PD-1＃84651（绿色，左图）或 CD4＃25229（青色，右图）对小鼠胶质母细胞瘤肿瘤组织进行多重 IHC 分析。为了测试剥离效率，随后如文中所述使用 SignalStain Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 进行仅二抗孵育，并用 Cy5 酪胺偶联物（红色）进行检测。
一个称为表位遮蔽的现象是会在进行多重实验时增加获得准确染色的复杂度的另一个因素。对于位于某个组织中相同细胞的相同亚细胞区室的表位，如果一个组合中存在针对这些表位的多种抗体，就会出现表位掩蔽。酪胺会沉积在组合中首个这样的表位上，因此它会遮挡您尝试在组合靠后位置进行染色的周围表位。在下面的例子中，在检查小鼠同源肿瘤细胞的免疫浸润物的组合中，CD3 和 CD8 没有重叠，这引起了我们的注意。
如上所示，领域内的红色 CD8+ T 细胞大都不包括绿色 CD3+ T 细胞。虽然这些肿瘤浸润物可能包括树突细胞和自然杀伤细胞等 CD8+/CD3- 细胞亚群，但我们无法预计领域内的多数 CD8+ 细胞会归入这个类别。由于 CD3 和 CD8 是我们预计用于对相同小 T 细胞的相同小膜进行染色的靶标，表位掩蔽可能用来解释这些观察。
有几种方法可以处理表位掩蔽。通常，切换这些表位染色的顺序便足以解决这个问题。我们的 CD8/CD3 示例便是如此。正如您可以在下面看到的，一旦将 CD3 放在序列中的第一位，那么便可观察到这两个靶标之间的预计重叠量。
某些蛋白的表达水平与其他蛋白差别较大，相较其他蛋白，其较高的表达可能会使其较不可能被沉积酪胺明显掩蔽。表位构成本身（即其所含的酪氨酸量）也可能导致其较为可能或较不可能被前一轮沉积的酪胺掩蔽。
如果切换抗体序列不足以缓和表位掩蔽问题，那么可以逐步使用其他方法以在靶标之间取得更好的平衡。这些方法包括滴定二抗、滴定酪胺-荧光团复合体本身或优化孵育时间（二抗和/或酪胺-荧光团复合体）。
最后，当预计会存在于某些细胞类型上的某个标记物近乎完全缺失时，可以很容易地发现表位掩蔽，而在其他例子中这可能更难发现。例如，T 细胞耗竭标记物还位于同一 T 细胞的膜上，但并不总是存在，因为耗竭的存在和耗竭水平在肿瘤细胞之间有所不同。
为了确保表位隐蔽或其他因素不会使您的染色水平下降，我们建议您在对单重荧光玻片染色的同时，也对使用理论上最佳的条件制备的多重玻片进行染色。在认为您的组合已完全优化前，确保在多重玻片和单重玻片中，针对每个靶标染色呈阳性的细胞数量不存在显著上升或下降。这最后一个步骤可确保不仅可以提早发现表位掩蔽，而且您所观察到的每个多重靶标的信号水平都可以准确反映您样品中的生物学。
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