DIA 蛋白质组学如何为靶向蛋白质降解 (TPD) 项目降低风险

靶向蛋白质降解 (TPD) 项目正飞速推进，但许多项目仍受阻于同样的瓶颈：证明目标蛋白降解、绘制脱靶效应图谱，以及以足够的洞察力理解作用机制从而做出可靠决策。

液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 蛋白质组学可以通过在单次工作流程中提供对蛋白质丰度和泛素化修饰的无偏倚的定量视角，来帮助您克服这些挑战，即使在针对目的蛋白尚无抗体或抗体性能不佳的情况下，也能获得宝贵的生物学信息。

Alissa Nelson 博士 蛋白质组部门首席科学家

“靶向蛋白质降解的最大挑战不在于寻找降解剂，而在于证明它们在整个蛋白质组中究竟发挥着怎样的作用。 当您将 DIA 蛋白质组学与泛素残基富集技术相结合时，您所测量的不仅仅是某个蛋白质是否被降解——您还能观察到驱动这一变化的泛素化事件。”

在本篇博客中，我们将探讨基于抗体的检测方法与基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组学如何在 TPD 工作流程中实现协同互补：究竟哪些问题仅凭基于抗体的检测方法即可解答？何时需要引入蛋白质组学手段？这两种技术又是如何结合应用以对一种雄激素受体降解剂进行全面表征的？此外，我们还将为您提供一套实用的 TPD 蛋白质组学工作流程，供您在自己的实验室中参考借鉴。

您了解您的降解剂，我们可以帮助您揭示它的真正作用。请与我们的蛋白质组学科学家交流，讨论在 CST 开展验证、选择性或作用机制方面的研究。

为何选择基于质谱的蛋白质组学用于靶向蛋白质降解？

靶向蛋白质降解利用细胞天然的蛋白质处理机制（包括泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径）通过使用 PROTAC 和分子胶等小分子降解剂来清除致病蛋白，而非像传统抑制剂那样仅仅阻断其活性。

开发靶向蛋白质降解化合物需要进行广泛的验证，而基于质谱的蛋白质组学可以作为一种重要工具，高效地完成这一关键任务，既可以补充现有的抗体应用，也可以弥补抗体试剂的不足。蛋白质组学能够精确测量全局蛋白质水平的变化，以及泛素翻译后修饰 (PTM) 和其他重要的调控性翻译后修饰，从而评估化合物活性。

蛋白质组学首席科学家 Alissa Nelson 博士解释道：“由于蛋白质丰度和泛素翻译后修饰是在同一项研究中同时测量的，您无需进行额外的检测，就能区分仅发生在蛋白质水平的变化、仅发生在翻译后修饰水平的变化，或是两者协调一致的变化。正是这一点让您能够在单次蛋白质组学运行中，将真正的底物与间接效应区分开来。”

相反，基于抗体的技术，包括泛素化检测和基于 TUBEs 的工作流程，对于针对特定蛋白质、位点或通路的靶向性、假设驱动型问题而言，可以成为强有力的检测手段。

在实践中，大多数团队会先采用基于抗体的检测方法来确认靶点结合及通路效应，随后在需要对靶向和脱靶生物学效应形成更全面认知时，再引入蛋白质组学分析。例如，在以下情况下使用基于质谱的蛋白质组学：

• 大规模评估降解效率：在蛋白质组水平上定量测量靶标蛋白水平的降低，以确认有效降解并对降解剂的效力进行排序。

• 评估选择性与脱靶降解：利用全局蛋白质组分析来检测非预期脱靶蛋白的降解情况，有助于远在体内研究开展之前，便对化合物的特异性及潜在毒性进行评估。

• 确定作用机制 (MoA)：利用全局泛素翻译后修饰蛋白质组学分析，确认三元复合物的形成以及泛素-蛋白酶体系统的作用，以鉴定驱动靶向和脱靶蛋白降解的特定赖氨酸位点。

• 识别和监测生物标志物和通路响应：测量参与关键信号转导通路调控的蛋白质和翻译后修饰生物标志物，用于预测患者应答、监测药物疗效，并证明靶蛋白耗竭产生了预期的下游效应（体现于翻译后修饰信号转导和/或蛋白质水平的变化）。
  

那么，应该使用抗体检测还是蛋白质组学，或者两者并用？在利用蛋白质组学工作流程时，有几点事项需要加以注意。与基于抗体的检测相比，液相色谱-质谱联用需要更长的周转时间，且样品制备过程也更为复杂。

Nelson 补充道：“在靶向蛋白质降解领域，蛋白质组学不会取代基于抗体的检测，反之亦然。这两种策略是协同工作的；抗体有助于确认您预期的结果。蛋白质组学则能发现您未曾预料到的结果。” 

通常对于团队而言，最佳策略是先从基于抗体的泛素化检测和 TUBEs 入手，以获得快速的靶向读数，然后随着降解剂的推进以及研究问题从“它是否有效？”转变为“它是如何以及在何处起效？”，再有策略地引入蛋白质组学。

正在使用基于抗体的检测？如需深入了解用于靶向蛋白质降解研究的基于抗体的泛素化检测和 TUBEs 工作流程，请阅读配套博文。

案例研究：雄激素受体降解剂的蛋白质组学表征

在 2025 年 TPD Keystone 会议上，CST 首席科学家 Alissa Nelson 展示了如何利用深度蛋白质组学分析来验证前列腺癌细胞中雄激素受体 (AR) 的降解情况。Nelson 及其团队对一种人前列腺癌细胞系 (LNCaP FGC) 进行了蛋白质组学分析，该细胞系分别接受了降解剂分子 (ARCC4) 和非降解型抗雄激素内分泌治疗药物恩杂鲁胺 (Enza) 的处理。 

Nelson 表示：“通过将 DIA 蛋白质组学与泛素翻译后修饰富集技术相结合，我们能够在单次实验中同时观察到降解底物及其修饰位点，这使得研究团队能够更有把握地做出继续/终止决策。”

该团队利用 Thermo Scientific 的 Orbitrap Astral 质谱仪进行基于质谱的蛋白质及翻译后修饰分析，其定量了接近一万种蛋白质，并绘制了位点特异性的泛素化修饰图谱，从而获得了清晰、无偏倚的数据，这些数据不仅证实了靶向降解的有效性，还揭示了潜在的脱靶效应，并定位了参与降解过程的确切分子位点。

研究问题：ARCC4 能否实现选择性的雄激素受体降解？

研究团队旨在比较一种靶向雄激素受体的降解剂 ARCC4 与临床上使用的抗雄激素药物恩杂鲁胺 (Enza) 在人前列腺癌细胞系 (LNCaP FGC) 中的作用。研究目标包括：

• 确认雄激素受体 (AR) 发生了稳健、剂量依赖性的降解

• 鉴定受到 ARCC4 处理影响的其他蛋白质

• 确定所观察到的降解事件是否与特定赖氨酸位点的泛素化改变相关联

研究方法：DIA 蛋白质组学联合泛素翻译后修饰富集

细胞经不同浓度的 ARCC4 或恩杂鲁胺处理，并分别在存在或不存在蛋白酶体抑制的条件下进行。使用 Orbital Astral 分析仪，以数据非依赖性采集 (DIA) 方法（图 1），采用标准的自下而上蛋白质组学样品处理流程，分别进行全局蛋白质组和泛素翻译后修饰蛋白质组分析。

作为蛋白质组学分析的补充，团队同时进行了标准的蛋白质印迹 (WB) 分析，以确认 ARCC4 处理能够诱导剂量依赖性的雄激素受体降解，其降解程度高于恩杂鲁胺处理组所观察到的水平，并且该降解过程依赖于蛋白酶体活性（图 3）。这一蛋白质印迹步骤有助于利用经过充分验证的抗体试剂来验证降解剂分子的靶向活性。但若缺乏充分信息且未使用额外抗体，该步骤无法提供关于脱靶效应的信息。

图 1. 经雄激素受体降解剂处理的细胞的蛋白质组与泛素化组分析。（使用 Biorender.com 创建。Thermo Scientific Orbitrap Astral 质谱仪图片由 Business Wire 提供）

基于 DIA 的蛋白质组学工作流程包含三个主要步骤：

1. 全蛋白质组分析：在 Astral Orbitrap 质谱仪上进行深度 DIA 采集，随后对所有样品条件下的蛋白质丰度进行定量分析。

2. 泛素翻译后修饰富集与分析： 采用 PTMScan^® HS 泛素残基 (K‑ε‑GG / diGly) 工作流程分离泛素化肽段，并进行基于 DIA 的位点特异性泛素化数据采集。

3. 整合数据解析：针对大多数检测到的蛋白质，研究获取了重叠的蛋白质水平测量值与泛素翻译后修饰测量值，并将关键泛素化位点定位至雄激素受体的 3D 结构上，以支持基于结构的优化研究。

结果：数据所揭示的信息

得益于 Astral Orbitrap DIA 分析所提供的深度蛋白质组覆盖，研究获得了相互补充的蛋白质水平测量值与泛素翻译后修饰测量值，且两者的蛋白质覆盖范围存在高度重叠（图 2）。 正是这种重叠，使得研究人员能够仅通过单次液相色谱-质谱联用实验，即可直接判断降解剂是仅改变了蛋白质水平、仅改变了翻译后修饰状态，还是对两者均产生了影响。

综合来看，这些数据证实了雄激素受体发生了稳健的降解，揭示了一组有限的脱靶底物，并将这些变化与特定的泛素化事件及雄激素受体的结构特征关联起来。这种分析深度与特异性的结合，充分说明了这些蛋白质组学应用如何能为靶向蛋白质降解药物的开发提供重要见解。

覆盖深度
在所有样品条件下，共有 9,978 种蛋白质获得了完整定量数据。 使用 PTMScan HS 试剂盒，在 8,704 种蛋白质上鉴定出 72,507 个泛素化肽段。 超过 80% 的已鉴定蛋白质同时拥有蛋白质定量数据与泛素翻译后修饰数据，使得分析剂量依赖性降解与位点特异性赖氨酸泛素化水平升高成为可能。	图 2. ARCC4 与恩杂鲁胺处理细胞的深度蛋白质组与泛素化组覆盖情况。

靶向降解与蛋白酶体依赖性
蛋白质印迹分析（图 3）证实，ARCC4 能够诱导剂量依赖性的雄激素受体降解，且在匹配剂量下，其降解程度高于恩杂鲁胺处理组所观察到的水平。 蛋白酶体抑制剂 MG132 的处理逆转了雄激素受体的降解，支持了该过程依赖于泛素-蛋白酶体系统的作用机制。 这些数据利用经过充分验证的 CST 抗体，验证了该降解剂的靶向活性。	图 3. 利用蛋白质印迹分析进行剂量选择与活性确认。抗体： AR #5153、PSA/KLK3 #5365、β‑Actin #4967。

脱靶降解和底物选择性
全局蛋白质组火山图显示，在 ARCC4 处理后，仅有一小部分蛋白质显著下调，其中雄激素受体如预期般减少。 凭借 DIA 全局蛋白质组分析的高灵敏度与多重检测特性，研究发现其他蛋白质也受到 ARCC4 处理的影响，反映了该药物的脱靶活性（例如 PDE6D 与 LYPLA2，图 4）。	图 4. 全局蛋白质组分析突出显示了多种被 ARCC4 降解的蛋白质。

位点水平的泛素化改变
对泛素残基肽段的翻译后修饰分析，实现了对蛋白酶体导向降解与泛素化过程的同步监测，有助于判断蛋白质水平的下降是否由靶标蛋白泛素化所驱动。 火山图（图 5）显示，在 ARCC4 处理后，雄激素受体的多个位点显著减少，而脱靶蛋白（如 LYPLA2）的特定位点上泛素化水平增加，但在 PDE6D 上则未观察到泛素化改变，这有助于区分真正的底物与间接效应。	图 5. 利用 PTMScan 分析表征 ARCC4 诱导的蛋白质组范围泛素化改变。

剂量依赖性的靶向与脱靶降解
在三种不同浓度的 ARCC4 与恩杂鲁胺处理下进行的全局蛋白质组分析显示，雄激素受体、PDE6D 及 LYPLA2 在所有条件下均有所减少，且在较高 ARCC4 剂量下呈现出持续下降的趋势（图 6）。 在 500 nM ARCC4 处理下，雄激素受体丰度降至 500 nM 恩杂鲁胺处理时的 33%；PDE6D 与 LYPLA2 也以剂量依赖性方式被降解。	图 6. ARCC4 靶向与脱靶底物的鉴定。

综合上述结果，这些数据阐明了 DIA 蛋白质组学与泛素翻译后修饰分析如何能够验证靶向活性、暴露脱靶风险，并提供机制层面的细节以指导降解剂设计，其分析深度远超仅使用蛋白质印迹和单一分析物检测所能达到的范畴。

想了解完整内容？获取 AACR 2025 研究海报优化的泛素残基 DIA 蛋白质组学实现 PROTAC 的高通量筛选，以探索完整的工作流程、图表和数据。

实用的靶向蛋白质降解蛋白质组学工作流程

一项典型的以靶向蛋白质降解为重点的蛋白质组学研究可遵循以下简单的四步工作流程：

第 1 步：设计并处理您的模型体系

• 选择合适的细胞系或模型体系

• 尽可能纳入剂量范围与时间进程

第 2 步：制备并富集您的样品

• 执行自下而上蛋白质组学样品制备

• 将样品材料分为以下几部分以用于：

  • 全局蛋白质组分析

  • 泛素残基富集 (PTMScan HS K‑ε‑GG)

  •  可选的其他翻译后修饰分析（例如酪氨酸磷酸化、丝氨酸/苏氨酸磷酸化），以记录细胞对有效（或无效）降解剂处理的信号转导应答
    

第 3 步：在高分辨率平台上采集 DIA 数据

• 在 Orbitrap Astral 分析仪等仪器上运行 DIA 采集，以最大限度地提高检测深度与定量可重复性

• 在不同条件下应用一致的采集参数，以确保能够进行可靠的比较

第 4 步：整合蛋白质、翻译后修饰与结构数据

• 定量分析不同条件下蛋白质丰度与位点特异性泛素化的变化

• 鉴定靶向与脱靶底物，确认 UPS 的参与，并将变化与通路读数相关联

• 将关键位点定位至蛋白质结构（实验结构或 AlphaFold 结构）上，以支持结构指导的降解剂优化

CST 的蛋白质组学服务团队能够帮助您调整这一框架，以补充本博客系列中其他部分所述的基于抗体的靶向蛋白质降解检测与泛素化工作流程。

超越雄激素受体：CST 蛋白质组学如何支持靶向蛋白质降解项目

CST 结合了专有的 PTMScan 富集试剂盒、在泛素与信号转导生物学领域深厚的专业积淀，以及在多个靶向蛋白质降解项目中积累的成功经验，以提供高水平的泛素化组与通路洞察。CST 蛋白质组学服务团队已支持了多项靶向蛋白质降解项目，包括：

• Hippo 通路中的泛 TEAD 降解：T. H. Pham 及其同事 (Genentech) 利用 CIDEs 促进高效的泛 TEAD 降解。泛素残基分析证实了 TEAD 泛素化、蛋白酶体导向的降解以及下游 Hippo 通路的抑制，从而支持将泛 TEAD 降解作为一种可行的治疗策略。³

• 使用 AdPROM 和 PROTAC 降解 Tau 及其他靶标： G. Sathe 及其合作者（邓迪大学）将全局蛋白质组学与 diGly PTMScan 富集及 DIA 质谱相结合，确立了多种靶向蛋白质降解模式的作用机制，展示了稳健的 Tau 降解，并广泛定位了泛素化位点，以优先选择具有强靶向结合力与明确选择性特征的降解剂设计。⁴

• FAK 降解剂与 FAK 抑制剂：将降解与信号转导相关联： Koide 及其合作者整合了全局蛋白质组、泛素化组与磷酸化分析，展示了 FAK 信号在降解后的丧失，为指导选择性 FAK 抑制剂与 FAK 降解剂的开发提供了依据，并改善了靶向 FAK 的 PROTAC 的激酶组范围选择性。⁵

我们的蛋白质组学服务团队拥有超过 25 年的经验，可根据您的目标提供定制的实验设计、样品制备、数据采集与数据分析服务。我们将与您密切合作，确保结果对您的靶向蛋白质降解项目具有生物学意义且切实可行。

凭借先进的 DIA 工作流程、PTMScan 富集平台以及在泛素与信号转导生物学领域的深厚专业知识，CST 能够帮助您：

• 设计将基于抗体的检测与全局蛋白质组学相结合的研究方案，从多角度验证降解剂活性

• 定量分析靶向与脱靶降解，并确认对泛素-蛋白酶体系统的依赖性

• 定位位点特异性的泛素化、磷酸化及其他翻译后修饰，将降解事件与功能性通路改变联系起来

• 支持从发现研究到转化研究阶段的作用机制、安全性及生物标记物策略

Nelson 表示：“靶向蛋白质降解团队比任何人都更了解他们的靶点与降解剂。我们的工作是通过蛋白质组学的深度分析，精准揭示这些分子在整个蛋白质组中的真实作用——从而让您能够充满信心地向前推进。”

欢迎联系我们，共同设计针对您降解剂的蛋白质组学策略，并了解 CST 蛋白质组学分析服务如何助力推进您的靶向蛋白质降解研究。请在此处提交查询。 

参考文献

1. Jumper J, Evans R, Pritzel A, et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 2021;596(7873):583-589. doi:10.1038/s41586-021-03819-2
2. Varadi M, Anyango S, Deshpande M, et al. AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D439-D444. doi:10.1093/nar/gkab1061
3. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System. Version 3.0. Schrödinger, LLC; 2020.
4. Matias PM, Donner P, Coelho R, et al. Structural evidence for ligand specificity in the binding domain of the human androgen receptor. Implications for pathogenic gene mutations. J Biol Chem. 2000;275(34):26164-26171. doi:10.1074/jbc.M004571200
5. Pham TH, Pahuja KB, Hagenbeek TJ, et al. Targeting the Hippo pathway in cancers via ubiquitination‑dependent TEAD degradation. eLife. 2024;13:e92450. doi:10.7554/eLife.92450
6. Sathe G, Röth S, Gelders G, et al. Data‑independent acquisition (DIA) approach for comprehensive ubiquitinome profiling in targeted protein degradation. bioRxiv. Preprint posted 2025 年 5 月 27 日. doi:10.1101/2025.05.27.656291
7. Koide E, Mohardt ML, Doctor ZM, et al. Development and Characterization of Selective FAK Inhibitors and PROTACs with In Vivo Activity. Chembiochem. 2023;24(19):e202300141. doi:10.1002/cbic.202300141
8. Salami J, Alabi S, Willard RR, et al. Androgen receptor degradation by the proteolysis-targeting chimera ARCC-4 outperforms enzalutamide in cellular models of prostate cancer drug resistance. Commun Biol. 2018;1:100. Published 2018 Aug 2. doi:10.1038/s42003-018-0105-8