检测细胞内蛋白质和 RNA 的能力一直是单细胞研究的一个挑战。然而，同时分析 RNA 和蛋白质，可以直接测量细胞类型对 RNA 水平和蛋白质表达的影响，从而揭示生物学过程中的新机制，并进一步阐明其在疾病机制和治疗反应中的作用。
多年来，研究人员一直致力于开发这种检测方法，但在不降解 RNA 的同时，准确捕获细胞内蛋白质数据及其翻译后修饰 (PTM) 始终是一大难题。尽管一些新方法已经取得了进展，但它们在不同领域、实验室和应用中的可重复性仍然存在问题。
因此，可以理解的是，InTraSeq 检测方法承诺能够实现这些目标，听起来可能有些过于理想。当我们询问科学家对此的看法时，许多人表示他们需要亲眼看到实际效果，才能打消疑虑。
“我对[InTraSeq 技术]感到非常兴奋。但我更看重的是它的可靠性。[更重要的是]需要看到确凿的证据。我是个怀疑论者”。
~ 学术科学家
本博客提供了我们对 InTraSeq 检测的一些验证数据，展示了其准确性、灵敏度和可重复性。该项研究发表在预印本论文《InTraSeq：揭示新的单细胞生物学和调节机制的多模态分析》中，研究由布莱根妇女医院、麻省总医院、哈佛医学院、麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所以及巴塞尔大学的科学家合作完成。
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许多分析利用刺激性化学物质破坏细胞膜，从而导致 RNA 降解和丢失。因此，在单细胞、多组学实验中保持 RNA 完整性一直是整个行业的挑战。InTraSeq 试剂旨在温和地通透细胞和核膜，使抗体能够进入细胞，同时有效防止 RNA 泄漏和降解。由于 RNA 被保留，可以从 InTraSeq 检测中获得高质量的 scRNA-seq 分析数据。
为了验证 InTraSeq 检测能保留 RNA 的完整性，我们在三种不同条件下比较了来自同一供体的外周血单核细胞 (PBMC) 的转录组：
进行标准的 10x Genomics Chromium Single Cell 3’ 实验并在上述三种条件（“活性细胞”、“仅 RNA 的 InTraSeq 分析”和“含 RNA+ADT 的 InTraSeq 分析”）中匹配每个细胞的测序读数后，每个细胞检测到的总 UMI 和识别的基因数量在这三种样本类型中几乎相同，如图 1 所示。
对 RNA 图谱的进一步分析发现，与活细胞对照组相比，两个 InTraSeq 样本在线粒体、核糖体和其他基因转录本的表达水平上表现出相似的结果，如图 2 所示。
以下部分概述了额外的实验，从而证明 InTraSeq 检测可以产生高质量的 scRNA-seq 数据，可用于可靠地识别细胞类型和亚型。
为了验证 InTraSeq 检测是否可以同时保留和检测细胞类型标记物基因的细胞异质性，对上述三个 PBMC 样本的数据集进行了无监督 scRNA-seq 聚类分析。
结果如图 3 所示，从而表明三个样本的 B 细胞、T 细胞、NK 细胞、单核细胞和其他细胞类型的组成相似。存在的细胞数量和类型与基于先前发表的实验预期的细胞组成一致。1
使用来自不同 PBMC 供体的三个额外生物学重复样本，进一步证实了这种细胞类型检测的一致性，其结果如图 4 所示。InTraSeq 检测不仅能够保留 RNA 的完整性，还能保持样本的细胞异质性，进一步证明了该方法的可靠性和可重复性。
还对来自三个 PBMC 样本的数据集进行了超过 20 个标记物基因（例如 CD14、CD19、CCR7、IL7R 等）的更深入分析。该分析表明，在“活性细胞”、“仅 RNA 的 InTraSeq 分析”和“含 RNA+ADT 的 InTraSeq 分析”这三种条件下，每个细胞簇中的主要 RNA 标记物都很相似，如图 5 所示。与未经处理的活细胞相比，这些数据为使用 InTraSeq 实验步骤处理的细胞中的 RNA 质量提供了额外的验证。
InTraSeq 技术的一个主要区别在于它能够检测和量化细胞内和表面蛋白质，从而识别异质细胞群。与仅能检测细胞表面蛋白的 CITE-Seq 相比，InTraSeq 技术为科学家提供了无偏见地研究复杂的细胞内信号转导通路的工具。
为了验证 InTraSeq 技术能准确测量细胞内和表面蛋白质，我们比较了在异质性 PBMC 样本中检测到的 RNA 和蛋白质信号。蛋白质表达模式与检测到的 RNA 水平一致，从而表明 InTraSeq 检测可以准确测量目标细胞中的蛋白质。
例如，正如预期，表面标记物 NCAM1 的 RNA 和蛋白质靶标仅在 NK 细胞中被检测到，而细胞内靶标 AIF1 在单细胞蛋白质和 RNA 模式下都能准确地在单核细胞中被检测到（图 6）。
值得注意的是，InTraSeq 检测中检测到的蛋白质表达水平比发现的 RNA 水平更具变化性，显示出更广泛的检测范围。这可以在 Foxo1 和 NFATC2/NFAT1 靶标中观察到，其中蛋白质信号比 RNA 信号更强。
接下来，为了验证 InTraSeq 检测到的蛋白质信号，在另一个 PBMC 样本中进行了流式细胞术分析。流式细胞术结果与 InTraSeq 数据集高度一致，如图 7 所示。使用流式细胞术的这一交叉验证方法，证明了 InTraSeq 检测单细胞蛋白质数据的可靠性。
尽管蛋白质印迹法最常用于研究低丰度 PTM，但这种方法无法提供单细胞层面的数据。相比之下，许多单细胞分析方法在定量分析 PTM 等瞬时事件时面临挑战，且结果通常缺乏可重复性。InTraSeq 技术的关键优势在于，它能够在单细胞水平上可靠地获取低丰度靶标的 PTM 数据。
为了评估这一能力，研究人员分离了初始 CD4+ T 细胞，并将其分化为 Th0、非致病性 Th17 (npTh17) 和致病性 Th17 (pTh17) 亚群。此外，还通过 PMA/IO 刺激初始 CD4+ T 细胞 10 分钟，以诱导磷酸化反应，从而为研究短期蛋白质修饰提供了实验模型。
接下来，对初始样品和分化样品分别进行了传统的蛋白质印迹 (WB) 和单细胞点图分析。结果表明，在不同的检测方法和实验条件下，PTM 水平一致（见图 8），突出显示了 InTraSeq 检测在精确量化短期和低丰度 PTM 变化方面的优势。此外，由于实验使用了不同生物学重复样本，进一步验证了 InTraSeq 检测的可重复性。
25 年来，CST 一直以其高品质抗体试剂享誉业界，并成为研究细胞内信号转导事件和 PTM 的首选抗体供应商。InTraSeq 技术将这种无与伦比的专业知识扩展到单细胞分析领域，超越蛋白质印迹法的应用范围。
“我们很高兴看到研究人员开始采用 InTraSeq 技术，并迫不及待地想了解更全面的数据集如何助力揭示新的疾病机制，”CST 资深科学家 Majd Ariss 说道，他在 InTraSeq 技术的开发过程中发挥了关键作用。“我们还认为研究人员会特别喜欢该检测方法简洁明了的实验步骤，它提供了多个暂停点，并且仅需一个小时的实验室工作时间即可完成。”
阅读 bioRxiv 上的完整预印本论文，进一步了解 InTraSeq 的验证数据，并探讨如何在实验环境中使用 InTraSeq 技术来识别新的调控机制。
“该研究使用 InTraSeq 技术来探究 Th17 细胞的分化过程，并揭示了一些意想不到的结果，”Ariss 解释道：“InTraSeq 提供的更全面的数据集显示了 Th17 细胞分化过程中转录基因谱和蛋白质表达水平之间的关键差异，这一发现或将影响我们对 T 细胞活化机制的理解。”
InTraSeq 检测技术能够在单细胞水平同时检测 RNA、细胞内蛋白质和细胞质蛋白质，为研究人员提供了一种强大工具，有望深化对细胞异质性、疾病机制及治疗反应的理解。
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Ding J, Adiconis X, Simmons SK, et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol. 2020;38(6):737-746. doi:10.1038/s41587-020-0465-8
本博客与 CST 资深科学家 Majd Ariss 合作撰写，他在 InTraSeq 技术的开发过程中发挥了关键作用。