数十年来，免疫组织化学 (IHC) 一直是在自然组织学背景下研究和可视化细胞成分的强大技术。IHC 在医学中已成为重要工具，可以诊断复杂的病理状况，在基础研究中可以增进对关键生物学过程的理解。
IHC 方案涉及许多步骤（从组织处理到信号检测），需要大量时间和受过训练、专业知识丰富的技术人员才能手动完成。近年来，通过开发自动化方法，IHC 的任务得到了极大的改善。像 Leica® Bond™ 之类的自动染色机可以增加工作量，同时还可以提高染色的一致性和可重复性。但是，像手动染色一样，自动 IHC 要求定制每种方案以适合每个实验的特定需求。
在另一篇博客文章中，我们概述了 IHC 的基本原理以及使用双显色染料优化手动检测两个目标靶标的指南，这些步骤可轻松适用于自动染色机。该程序中的一个关键建议是选择在不同宿主种属中产生的经过验证的抗体，以检测单个靶抗原。这样做限制了信号转导处理过程中交叉反应的可能性。但是，验证来自不同宿主种属的一抗并非总是只有一种选择。在这种情况下，有必要建立最佳方法，对同一宿主种属中产生的一抗进行双重染色。
使用同一种属中产生的一抗，需要采取哪些步骤来优化通过 IHC 的两种抗原顺序检测？与使用来自不同宿主种属的一抗一样，第一步是对单个一抗/色原对进行对照染色，以建立检测每种抗原的基线。由于结合亲和力和反应性的差异，重要的是混合和匹配一抗和色原标记的二抗，以鉴定最佳组合。
接下来，必须开发并测试抗体剥离步骤，以去除一抗染色后残留的一抗，以限制二抗检测过程中的交叉反应。可以通过以下方式确定有效的剥离：用针对抗原 #1 的一抗进行组织孵育，用剥离缓冲液去除抗体，然后添加针对抗原 #2 的检测试剂。检测到的任何信号都表明存在残留的一抗，该残留的一抗可能会破坏顺序检测抗原 #2 后的结果解释。
应当对每个一抗/色原对进行剥离优化。显示最有效剥离的配对将决定顺序染色中的操作顺序，即在双重染色中应首先使用在剥离测试中显示很少或没有染色的抗体/色原对。遵循这些步骤对源自相同宿主种属的一抗进行双重染色，可确保对其最终判定的把握。
有关此过程的更多详细信息，我们建议您参考我们最近的应用说明：在 Leica®Bond™ 上优化小鼠 CD8 和 FoxP3 双重染色。