单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 一直是揭示 T 细胞群体异质性的有力工具。然而，在研究经过工程化改造的 T 细胞时，仅凭 RNA 数据无法确认哪些细胞真正表达了 CAR 蛋白。尽管病毒转导可能将转基因递送至 T 细胞中，但这并不能保证 CAR 结构在细胞表面得以正确表达或展示——这对 CAR-T 研究而言是一个至关重要的区别。
针对基于 scFv 的 CAR 连接序列设计的 InTraSeq™ 偶联抗体，通过为单细胞分析提供直接的蛋白质水平信息，推动了新一代 CAR-T 研究的发展。这些工具通过靶向基于 scFv 的 CAR 中常用的 Whitlow/218 或 G4S 连接结构域，能够准确区分 CAR 阳性的工程化细胞与未转导的旁观细胞。
由此获得的数据集更具特异性，分析解读更为精准，最终能更深入地揭示潜在的治疗反应机制。
在单细胞研究中直接实现 CAR 分子的蛋白质水平检测
在单细胞实验中直接测量 CAR 蛋白的表达，使研究人员能够确保他们鉴定到的是真正表达 CAR 的细胞，而不仅仅是含有 CAR 转录本的细胞。
例如，Whitlow/218 连接子 InTraSeq 接合物被用于识别转导了含有 Whitlow/218 连接子 CAR 结构的 T 细胞。在细胞群体中，并非所有病毒转导的细胞都表达了 CAR 蛋白（图 1），这凸显了直接进行蛋白质检测对于区分 CAR 阳性细胞与非表达细胞的价值。
这种蛋白质水平的数据使得非表达细胞得以从数据集中排除，从而提升了数据质量。为验证试剂的准确性，这些结果进一步通过流式细胞术进行了确认（图 1C）。
图 1. 未转导的 T 细胞或转导了含有 Whitlow/218 连接子的基于 scFv 的抗 BCMA (C11D5.3) CAR 的 T 细胞，均按照 InTraSeq™ 3’ 实验步骤进行处理。左图：注释细胞簇的 UMAP 图。中图：Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3053) #50265 的表达情况。右图：使用 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #69310，对未转导的 T 细胞或转导了含有 Whitlow/218 连接子的基于 scFv 的抗 BCMA (C11D5.3) CAR 的 T 细胞进行交叉验证的流式细胞分析。
使用 InTraSeq CAR 连接子接合物进行活细胞、固定前检测，以实现灵活的工作流程
InTraSeq CAR 连接子接合物还能在固定前于活细胞中检测基于 Whitlow/218 连接子和 G4S 连接子的 CAR，从而支持广泛的下游实验工作流程。
在一项并行研究中，G4S 连接子 InTraSeq 接合物在活细胞染色工作流程中接受了性能测试。如图 2 所示，经过工程化改造、表达含有 G4S 连接子 CAR 的 Jurkat 细胞显示出清晰的特异性检测信号，而野生型 Jurkat 细胞或表达含有 Whitlow/218 连接子 CAR 的工程化 Jurkat 细胞则保持阴性。
图 2. Jurkat 细胞、表达含有 G4S 连接子 CAR 的 Jurkat 细胞以及表达含有 Whitlow 连接子 CAR 的 Jurkat 细胞，均按照 InTraSeq 3’ 实验步骤进行处理。FeaturePlots 展示了 G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq 3' Conjugate 3118) #38470 在各样本中的表达情况。
利用 InTraSeq 技术在单细胞检测中测量 CAR 表达
在单细胞检测中应用 InTraSeq 技术测量 CAR 表达具备多项优势：
- 提升 CAR 鉴定的准确性：精准检测 CAR 阳性的工程化细胞，可在不受周围未转导 T 细胞干扰的情况下，实现对 CAR-T 细胞群体的精确分析。此外，该技术还可在单细胞数据集中追踪 CAR 蛋白表达动力学及 CAR 结构稳定性。
- 下游功能检测： 通过将 InTraSeq CAR 连接子接合物与 InTraSeq 3’ 混合物（混合物 1+2+3）联合使用，研究人员可在同一 scRNA-seq 实验中将 CAR 表达与下游信号转导蛋白相关联。这种多组学方法可提供对下游功能性读数（如细胞因子释放、信号转导通路激活及 CAR-T 细胞杀伤活性）的直接洞察。
- 评估 CAR-T 对邻近细胞群体的影响：在复杂细胞环境中，InTraSeq 技术有助于揭示表达 CAR 的细胞如何在 RNA 和蛋白质水平上影响邻近细胞，从而为混合细胞群体中 CAR-T 生物学机制提供更为完整的解析视角。
面向下一代 CAR-T 研究的整合式蛋白与 RNA 分析
两款 InTraSeq 抗 CAR 连接子抗体均可与 InTraSeq 混合物（混合物 1+2+3）兼容，支持同步分析 CAR 表达与转录因子、代谢标记物及信号转导蛋白。
这一功能为探索全新生物学机制开辟了路径——在单细胞层面将 CAR 表达及信号转导状态与转录程序直接关联。对于从事 CAR-T 生物学、免疫异质性或治疗作用机制研究的科研人员而言，InTraSeq 试剂可助力开展更为全面的单细胞研究，从而揭示单个细胞内蛋白质与 RNA 生物学的全景图谱。
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