CST 博客: 实验室展望

Cell Signaling Technology® (CST) 官方博客,在这里我们讨论您在实验台前工作时的期望,分享贴士、技巧和信息。

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一切在于亲和力

2012 年,Roux 等人在 Journal of Cell Biology 发表了一项开创性方法,用于鉴定核纤层蛋白(核纤层蛋白 A 或 LaA )的相互作用物。利用以下这项新颖新技术允许 LaA 的细胞近邻者生物素化:使大肠杆菌衍生的生物素连接酶 BirA 蛋白与 LaA 融合并在细胞中表达所得融合蛋白。利用链霉亲和素珠回收生物素化的蛋白质,并用胰蛋白酶从珠上使其消化下来。使用质谱法鉴定所得肽。自那时以来,关于高等真核生物、异种移植物、寄生虫如刚地弓形虫和开花植物的细胞和组织中使用这种(及相关)邻近标记技术,已有 7000 多篇文章发表。

 

然而,链霉亲和素对生物素的近共价亲和力 (KD~10-14 M) 意味着生物素化的肽和修饰位点仍然牢固地与珠子结合。无法直接鉴定生物素化肽可能令数据分析更困难,因为一旦生物素化的蛋白质被修饰,它们可能容易与背景、非特异性结合的蛋白质混淆。对于像邻近标记这样的研究,鉴定生物素化位点为相互作用位点提供直接证据。

 

因此,科学家们不得不揭示他们已成功富集之物的极致情形启发来自 Broad Institute 和 Cell Signaling Technology® (CST®) 的科学家们创造新颖方法来显著改进生物素化肽的回收。为了实现这一目标,他们利用基于抗体的免疫富集技术和创新型洗脱条件的组合回收含生物素的肽。

 

2017 年,Udeshi, N. 等人在 Nature Methods(Nature Methods 第 14 卷,第 1167-1170 页)上发表了一种利用抗体从近距离标记实验中选择性富集生物素化肽并使用质谱鉴定这些肽的方法。相比使用链霉亲和素珠的既定方法,布罗德研究所卡尔实验室的这种新方法导致生物素化位点鉴定过程改进 30 多倍。

 

同时,利用自身在制造 PTM 特异性富集试剂方面的经验,CST 的科学家们已开发出自己的抗生物素兔单克隆抗体。

CST 科学家随后与 Broad 研究所 Carr 实验室的科学家合作,展示利用质谱法进一步改进生物素化肽捕获、释放和鉴定方法。在美国质谱学会 (ASMS) 2019 年会的海报展示中,两个团队展示了各种市售抗生物素抗体之间令人信服的比较数据,表明 CST 的抗生物素抗体在已鉴定生物素化肽的种类数和富集过程的总体特异性方面胜过所有其他抗体。直接比较时,CST 抗生物素抗体充分回收了超过 4000 种独特的生物素化肽,相比之下,最匹敌的竞争者回收 800 种,特异性胜出超过 2 倍,即 40% 对 17%。作者将灵敏且特异的抗体与创新型洗脱条件的组合总结为对形成“研究翻译后修饰 (PTM) 及其生物学意义的稳健策略”的主要贡献。

 

如需了解更多信息,请访问液相色谱/质谱蛋白质组学资源中心

Charles F
Charles F
Chuck Farnsworth 是蛋白质组学应用科学家;他的重点是帮助世界各地的科学家使用 CST 的蛋白质组学试剂盒获得最好的数据。与孩子们一起露营并在佛蒙特州的疯狂河谷观星是他最喜欢做的事情。

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