If you’re running complex IHC on precious FFPE samples, you already know the tradeoff: every marker you add gets you closer to the biology, but also adds development time, optimization, and risk.
Yet expanding your panel is often the only way to answer the questions that really matter.
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Are your T cells actually engaging tumor cells or just nearby?
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Are key checkpoints co-expressed in the same tumor microenvironment or spatially segregated?
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Is stromal architecture physically or functionally suppressing immune infiltration?
These are spatial biology questions, and they require a flexible, robust antibody panel. The challenge is unlocking that missing marker without burning weeks on assay development and wasting irreplaceable FFPE tissue on trial-and-error.
SignalStar oligo-based multiplex immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human lung adenocarcinoma using OX40 (ACT35) Mouse Monoclonal Antibody #98785 detected with Anti-mouse IgG SignalStar® Secondary Antibody Kit #50528 (488; green), CD44 (E7K2Y) Rabbit mAb #37259 (594; yellow), CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb #3528 (647; red), Pan-Keratin (C11) Mouse mAb #4545 (750; cyan), Ki-67 (8D5) Mouse mAb #9449 (488; pink), MHC Class II (LGII-612.14) Mouse mAb #68258 (647; orange), and DAPI #4083 (blue). Staining was performed on the BOND RX autostainer by Leica Biosystems.
I started my career working in an IHC core facility, running DAB slides for a wide range of research projects. Although the biological questions varied, one thing was consistent: when timelines were tight and samples limited, we gravitated toward CST antibodies. Not just because of the breadth of the IHC portfolio, but because the antibodies worked.
Today, we’ve translated this broad portfolio into the SignalStar® Multiplex IHC assay, which gives you the reliability of CST reagents in a flexible multiplex workflow that lets you adapt your panel when the biology demands it. SignalStar is an oligo-based multiplex IHC (mIHC) assay validated for the detection of up to eight markers plus DAPI, and delivers quantitative spatial data in about two days.
这里有三种实用的方法，助您在无需从零开始的情况下扩展 mIHC 检测组合。
1. 直接偶联物：添加额外标记物最快捷的途径
当您需要快速推进时，直接偶联的一抗是扩展检测组合最简便的方法。
该方法采用经 IHC 验证且预先标记有荧光团的抗体，您可以将其整合至您的工作流程中，而无需更改核心的 SignalStar 化学体系。它们在孵育后即可直接成像，无需任何放大步骤。
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Kelsey Goldman 高级研究员 |
“如果您正在使用直接偶联物扩展 SignalStar 组合，应优先选择丰度较高的靶标。 您的核心 SignalStar 组合信号会被放大，但任何额外的直接偶联一抗则不会，因此您需要选择那些无需放大也能提供清晰信号的靶标。” |
根据您的组合设计方案，您可以通过两种主要方式将直接偶联物与 SignalStar 检测方案结合使用：
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在 SignalStar 染色之后：完成最后一轮 SignalStar 染色后，您可以使用荧光去除试剂盒；该试剂盒能够去除染色过程中的所有荧光信号，同时保留已结合的一抗。随后，您可以添加任意通道的直接偶联一抗。
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在最后一轮染色期间：直接偶联的一抗也可以在最后一轮 SignalStar 染色中，于连接步骤之后添加。在这种情况下，您只需审慎选择荧光基团，避免使用与 SignalStar 最后一轮成像所用荧光基团或通道相同的直接偶联抗体（例如，不要将 Alexa Fluor® 488 偶联的 CD4 抗体与同样在 488 nm 通道下检测的 SignalStar Vimentin 试剂搭配使用）。
SignalStar 检测方案利用 488、594、647 和 750 nm 四个荧光通道，分两个迭代染色轮次进行检测。通道 594 和 647 通常提供最强的信号，是低丰度抗原的良好选择，而 488 通道更容易受到自发荧光的影响，750 通道通常产生较弱的信号。结合靶标丰度来考量荧光基团的选择，有助于确保所加入的任何直接偶联物仍能产生可解读的信号。
2. SignalStar 二抗：快速、灵活的检测组合扩展方案
如果速度是您的首要考虑因素，同时又需要比直接偶联物更高的灵敏度，那么 SignalStar 二抗是扩展检测组合的另一条有力途径。
SignalStar 工作流程使用带有寡核苷酸标签的一抗，其核心标记物不依赖二抗。借助 SignalStar 二抗（提供抗兔和抗小鼠两种形式），您可以将任何兔源和/或小鼠源的一抗作为额外标记物纳入检测组合。
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图 1. 人鳞状细胞癌中的 COL1A 染色。右侧：使用非偶联一抗 COL1A1 (E8F4L) Rabbit Monoclonal Antibody #72026 和传统 DAB IHC 方案检测的 COL1A。左侧：使用同一种非偶联一抗和 Anti-rabbit IgG & CO-0055-594 SignalStar Secondary Antibody Kit #41483 在连续组织切片上检测的 COL1A，证明了其定位效果与原有方法相当，且荧光检测兼容多重分析。
鉴于我们经 IHC 验证的抗体中很大一部分属于兔源或鼠源重组单克隆抗体，这一策略使您能够立即使用大量经验证适用于 FFPE 组织 IHC 的试剂。
添加二抗确实会引入一些额外的步骤，并且像任何检测组合调整一样，需要一定的优化才能获益。使用标记二抗的间接检测法还具有信号放大的潜力，因为多个二抗可以结合同一个一抗，从而有助于检测丰度较低的靶标。我们建议您对一抗进行滴定，并进行 DAB 连续切片比对，以确认基于二抗的标记物的染色强度和模式与非偶联的亲本抗体一致。
3. 定制偶联：添加您真正需要的标记物
有时候，生物学问题并不在乎某个试剂是否“经过预验证”或“可直接用于检测组合”。
如果您的研究取决于某个特定的标记物——无论是罕见的免疫亚群、间质靶标，还是新兴的免疫检查点——您都可以通过定制偶联将其纳入 SignalStar 检测组合。
SignalStar 检测方案的核心在于偶联在经 IHC 验证的一抗上的专有寡核苷酸标签，这使得在 FFPE 组织上实现信号放大的荧光检测成为可能。通过与我们的抗体偶联团队合作，您可以将我们经 IHC 验证的一抗转化为与 SignalStar 兼容的试剂。
在我们团队的协助下，您将选定经 IHC 验证的一抗，以及您所需的 SignalStar 通道。一旦这些确定下来，我们会负责偶联至特定通道的技术规范，并协调 DAB 连续切片比对的交付。
当您需要追踪一个非常特异的靶标时，定制偶联是最灵活的选择。请联系我们的定制偶联专家，他们将全程为您提供指导。
解锁空间生物学洞见——预留扩展空间
Cell Signaling Technology (CST) 拥有业内最广泛且经过严格验证的 IHC 靶标产品组合之一，而 SignalStar 正是直接建立在这一基础之上。
无论您是使用直接偶联物扩展检测组合、通过二抗添加标记物，还是创建完全定制的寡核苷酸偶联试剂，您始终在一个专为 FFPE 组织设计、并由我们内部专家验证的框架内工作。这意味着您可以追随生物学发现的方向，不断扩展检测组合——纳入新的标记物、尝试新的组合、验证新的假说，而无需每次都重新开始验证。
换言之，您既能获得快速迭代的灵活性，又能确信在关键时刻，您的多重检测数据将经得起考验。
了解更多关于 SignalStar 多重 IHC 和 CST 空间生物学解决方案的信息：
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