抗体相容性三要素：选择多重分析策略以获得可靠的空间生物学见解

空间分辨多重检测将细胞表型和功能与组织结构联系起来，使研究人员不仅可以探究哪些标记物存在，还可以探究它们如何定位以及它们在疾病相关微环境中与哪些邻近细胞相互作用。灵敏、特异的抗体是这些工作流程的基础，因为空间读数的可靠性取决于其背后的检测试剂的可靠性。

选择合适的多重分析策略，并使其与您的样本类型、平台和抗体试剂相匹配，对于生成有意义的空间数据至关重要。许多具有重要功能的靶标，如磷酸化信号蛋白、检查点配体或细胞因子，表达水平较低，需要在复杂的组织中进行信号放大才能可靠地检测，而并非所有多重检测工作流程都支持这种能力。

对于需要灵敏、空间分辨检测和放大的 FFPE 组织，SignalStar® Multiplex IHC 可在短短 2 天内提供 8 重解决方案。

该博客重点介绍了常用的多重空间生物学平台和技术，并描述了如何选择与您的工作流程兼容的 CST^® 抗体和检测方法。

平台、工作流程和样本类型：抗体相容性三要素

对于大多数发现性研究和转化研究而言，与现有平台和工作流程的兼容性是一个重要的考虑因素——科学家必须最大限度地利用稀缺的患者样本，而且无法承担在独特且不可替代的组织样本上通过反复试错来开发方法的成本。为了取得成功，您需要确认哪种抗体形式与您的样本类型、首选的多重检测技术和平台兼容。在前期完成这些准备工作，有助于确保高价值样本得到高效利用，并使实验室能够在无需重新设计工作流程的情况下，从可行性研究顺利扩展到更大规模的队列研究。

抗体相容性需要考虑三个层面：

• 平台： 常用平台包括 Leica Biosystems 的 BOND RX 和 BOND RX^m 自动染色仪、Leica Microsystems 的 Cell DIVE 多重成像解决方案、Bruker 的 CellScape 精确空间蛋白质组学平台、Lunaphore 的 COMET 系统、Biocare Medical 的 ONCORE PRO X、Rarecyte 的 Orion 空间生物学平台、Akoya Biosciences 的 PhenoCycler Fusion 2.0 等。

• 工作流程： 多重技术包括显色染色与荧光染色；循环或顺序免疫荧光（例如，CycIF、seqIF）；基于组织的质谱分析、扩增策略等。

• 样品类型： 用于空间生物学的组织样本来自各种物种，通常采用福尔马林固定、石蜡包埋或冷冻固定的方式制备。

例如，这意味着经验证与 Cell DIVE 多重成像解决方案兼容的抗体偶联物，在 COMET 平台上未必总能表现出相同的性能。此外，并非所有经验证可用于人体组织的抗体也适用于小鼠组织，也并非所有适用于 FFPE 组织中的抗体也适用于冷冻组织。因此，多重检测板必须使用在相关平台、工作流程、物种和样品制备中已证明性能的抗体来构建。

最后，信号放大方法（如基于酪胺的化学方法或 SignalStar^® Multiplex IHC 中的寡核苷酸驱动放大方法）有助于揭示低丰度功能标记，而不会牺牲空间分辨率，并且还必须与实验中选择的抗体兼容。放大技术在免疫肿瘤学、神经生物学和其他机制研究中尤其有价值，可以在完整的微环境背景下检测细微的通路激活、罕见的细胞状态或翻译后修饰 (PTM)。

CST 抗体是多重空间生物学检测和工作流程的可靠基础。通过针对特定物种和应用的测试进行内部验证，确保所有抗体均符合严格的性能标准。这样，您就可以为 FFPE 或冷冻组织构建多重面板，因为您知道您的空间读数将是特异的、可重复的，并且可以跨平台和工作流程进行扩展。

CST 抗体平台兼容性

与现有仪器、染色工作流程和空间生物学平台的兼容性是避免重新验证整个流程并最大限度地利用有限组织块数据的关键。

虽然所有 CST 试剂都与平台无关，但以下常见平台列表可以帮助您选择抗体，并确定最适合您的仪器、样品类型和实验工作流程的 CST 产品。

除了上述现成产品外，CST 还提供生物素、荧光染料、寡核苷酸等的定制偶联和标记服务，可根据您的平台和工作流程，以兼容的偶联形式进行订购。

CST 抗体工作流程兼容性

不同的多重检测技术在多重检测水平、动态范围、通量和平台适配性方面各有优劣，因此选择最符合生物学问题、信号放大需求和可用仪器的检测工作流程非常重要。以下各节重点介绍何时使用多重显色免疫组化 (IHC)、多重免疫荧光 (IF)、基于组织的质谱分析和数字空间分析 (DSP)，并说明 FFPE 或冷冻组织的兼容性和典型平台。

多重荧光免疫组织化学 (mIHC) 或免疫荧光 (mIF)

Multiplex IHC 或 IF 利用抗体和荧光染料同时检测多种蛋白质。标准单轮 mIHC/IF 在传统荧光显微镜下通常每张载玻片可检测 4-5 个标记物，而多光谱显微镜可使用光谱解混技术分离每个 ROI (~0.66 mm²) 多达 ~8 个标记物。

多重 IF 可采用直接偶联抗体、未偶联的一抗与偶联的二抗组合，或采用 TSA 或 SignalStar mIHC 检测等信号放大方法进行。

循环或串行 mIF 方法（例如 CyCIF、SeqIF、IBEX）反复染色、成像和去除或灭活荧光团，以实现更高的多重水平，通常每个样本 30-60 个标记，同时保持空间背景——尽管增加了实验步骤的复杂性、更复杂的数据处理和潜在的组织压力。这些方法通常在 Cell DIVE、COMET 和其他循环 IF 系统等平台上实施，其中 CST 抗体作为核心构建模块，用于构建 FFPE 和冷冻组织中的高通量检测板。

博客：多重抗体荧光染色：多重免疫荧光直接法与间接法

SignalStar Multiplex IHC 将抗体、寡核苷酸和荧光染料结合起来，可在保持空间背景和组织结构的同时，对 FFPE 组织中的多种蛋白质进行放大、高通量检测。这种基于寡核苷酸的工作流程能够同时检测表型和低丰度功能标记，在短短 2 天内即可产生高达 8 重的数据，而无需抗体循环，从而节省了珍贵的组织。SignalStar mIHC 可以使用兼容的自动染色仪实验步骤在 Leica Biosystems 的 BOND RX 和 BOND RX^m 自动染色仪上运行，从而减少人工操作时间——自动运行大约需要 6 小时的仪器时间，而手动实验步骤则需要 14-16 小时。

使用 LRRC15 (E4X8J) Rabbit Monoclonal Antibody （594；绿色）、CD36 (E8B7S) Rabbit Monoclonal Antibody（647；yellow）、B7-H4 (D1M8I) Rabbit Monoclonal Antibody（750；red）、COL1A1 (E8F4L) Rabbit Monoclonal Antibody（647；cyan）和 DAPI #4083（蓝色）对石蜡包埋的导管乳腺癌组织进行 基于寡核苷酸的 SignalStar^® 多重免疫组织化学分析。在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上进行染色。

mIF 的关键考虑因素包括：

• 荧光团选择和光谱重叠：必须选择荧光染料以最大限度地减少串色和自发荧光，尤其是在 FFPE 组织中，通常优先选择窄带发射光谱的染料，并结合光谱解混技术。

• 定量： 荧光染料具有较宽的线性动态范围，可用于对标志物信号强度进行定量或半定量评估，这对于检测通路激活或蛋白质磷酸化的细微变化尤为重要。

• 信号放大：酪胺信号放大 (TSA) 和 SignalStar mIHC 可以提高低丰度靶标的灵敏度，但如果未进行适当优化，可能会引入阻断效应或表位掩蔽，因此需要进行严格的对照实验。

多重显色免疫组织化学

显色免疫组化 (IHC) 利用酶联检测技术，通过检测 DAB 或 AEC 等显色底物，在组织切片上可视化靶标。现代多重显色 IHC 在此基础上，采用不同的显色剂和精心优化的实验步骤，可在 10-15 小时内同时检测约 3-5 种标记物。最常用的平台包括 Leica Biosystems 的 BOND RX 和 BOND RX^m 全自动染色仪，以及罗氏公司用于 FFPE 组织的 Ventana DISCOVERY ULTRA 仪器。这些仪器支持在标准明场扫描仪上进行全切片成像，并提供半定量动态范围。

mIHC 的关键考虑因素包括：

• 半定量： 大多数显色底物的动态范围有限，因此只能进行半定量分析。

• 低重：由于显色底物数量有限，研究标记物共表达时通常可以组合 3-5 个标记物。

• 熟悉且经济实惠： 该工作流程相对经济便捷，利用了既定的实验步骤，并且很容易实现自动化，适用于高通量应用。

基于组织的质谱分析

基于组织的质谱分析使用金属标记的初级抗体，而不是荧光染料，从而可以同时显示 40 个或更多标记物，并且在 4°C 下染色 12 小时即可。与多重 IF 相似，它用于分析不同的 (1mm²) ROI，并提供基于金属离子计数的标记强度定量读数测量。

网络研讨会：优化成像质谱流式细胞术的关键考虑因素

多重离子束飞行时间成像 (MIBI-TOF) 和成像质谱流式 (IMC)，这两种技术在进行 TOF 分析之前，均通过不同机制从每个 ROI 生成离子。由于金属标签是通过质量而非波长进行区分，基于组织的质谱技术能够避免荧光标记常见的局限，例如光谱重叠、自发荧光和光漂白，然而，该技术需要专用且昂贵的仪器，并且在操作和数据解读方面需要经过系统培训。

构建高通量 MIBI-TOF 或 IMC 面板时，可使用 CST 无 BSA 和叠氮化物抗体，这些抗体已可直接进行定制金属偶联。

数字空间分析 (DSP)

数字空间分析（例如 NanoString 公司的 GeoMx Digital Spatial Profiler）是一种基于寡核苷酸的技术，它使用结合了紫外线可裂解荧光 DNA 标签的一抗来量化标记物。⁶ 虽然与多光谱显微术和基于组织的质谱分析相比 ROI 较小 (0.28mm²)，但是 DSP 可以检测更多标记物（实际检测 40-50，但理论上多达 800），只需一轮染色，并且需要的时间更短（1 小时）。DSP 的主要局限是它不会生成图像。相反，在将剪切的 DNA 标签转移到多孔板进行分析之前，最多使用 4 种荧光团标记的抗体选择 ROI。

使用可进行寡核苷酸偶联的 CST 无 BSA 和叠氮化物的抗体，构建与 DSP 兼容的检测面板。

多重实验的抗体选择

无论采用何种平台或工作流程，多重成像和空间生物学的成功都取决于使用高度特异性、经过检测验证的抗体，这些抗体与样品制备和物种反应性相匹配。选择在预期检测中经过验证的抗体（直接偶联物或二级检测），并确保其适用于 FFPE 或冷冻组织，同时确认其对相关物种（例如，人类、小鼠、非人灵长类动物）具有反应性，对于避免交叉反应和产生误导性结果至关重要。

CST 提供丰富的抗体产品组合，包括适用于 FFPE 组织 (IHC-P) 和冷冻组织 (IF-F) 的验证抗体，SignalStar Multiplex IHC 等多重/空间生物学解决方案，以及用于定制偶联的无载体抗体。每一款 CST 产品均采用内部验证方法，针对每个克隆开展一系列专门实验，以确保验证结果能够反映目标的生物学背景、应用和预期样本类型。对产品性能的这种承诺意味着 CST 抗体具有无与伦比的特异性、批次间一致且稳定的性能以及高质量的数据，从而帮助科学家更快地从实验中获得洞见。

• 对于 FFPE 组织，请使用经 IHC-P 验证的抗体，这些抗体经过广泛测试，已证实可在 10% 中性缓冲福尔马林（甲醛）固定并用石蜡保存的组织中发挥作用。
• 对于冷冻组织，请使用经 IF-F 验证的抗体，这些抗体经过广泛测试，已证实可在冷冻组织切片中有效发挥作用。
• 我们提供生物素、荧光染料、寡核苷酸等定制抗体偶联和标记服务，使您能够根据自身平台和实验流程需求，以兼容的偶联形式订购所需的抗体。
• 针对您的组织类型验证的定制和无载体抗体制剂，可让您将 CST 抗体偶联到 Akoya Phenocycler、基于组织的质谱系统和 Nanostring DSP 仪器等平台上。

如果未列出首选平台、工作流程或检测化学方法，您可以咨询 CST 专家来获取指导。对于多重检测面板设计、平台特异性抗体推荐或 mIHC、mIF、SignalStar、质谱或 DSP 工作流程中的故障排除，请联系 CST 技术支持以获得一对一指导。

其他资源：

• 博客：揭开多重 IHC 抗体组合设计的神秘面纱

• 博客：使用偶联抗体成功进行多重免疫荧光实验的策略

• CST 资源中心：多重检测和空间生物学资源中心

参考文献

• Taube JM, Sunshine JC, Angelo M, et al. Society for Immunotherapy of Cancer: updates and best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) image analysis and data sharing. J Immunother Cancer. 2025;13(1):e008875. Published 2025 Jan 8. doi:10.1136/jitc-2024-008875
  

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