CST 博文: 实验室展望

Cell Signaling Technology® (CST) 的官方博客,我们在此讨论您从工作台上可期望获得什么,分享提示、技巧和信息。

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用于筛选和定量细胞的工具

无论您是否致力于心脏研究,您都对研究神经退行性疾病感到兴奋,您对传染病研究的试验和磨难免疫或者愿意不惜一切代价阻止癌细胞的发展,我们都需要回答这个看似简单的问题:我的样本中有多少(插入最喜爱的靶标的名称)蛋白质?

每个靶标和实验问题都需要一种最适合该特定情况的测量方法,其中需要考虑以下几个因素:总体的科学问题是什么?我运用了多少和什么类型的样本?我是看一个还是多个靶标? 我需要粗略/定性测量还是非常准确/定量的测量?我需要高度灵敏的检测吗?样本中靶标的动态范围是多少?这个项目是否需要数月的前期设置工作,还是我最好使用更简单/更容易的方法?我甚至还有设备来运行这个项目吗?

 

这些方法范围很广,每种方法都有自己的优点和缺点。有一些方法可以直接测量您感兴趣的蛋白质,例如质谱法。当需要全局蛋白质组学测量时,这可用于发现项目,或在使用靶向蛋白质组学技术时对选定蛋白质进行灵敏定量。尽管是一种极其强大的工具,但与其他方法相比,质谱分析通常需要复杂的设备、工作流程、样品制备和分析。大多数其他分析方法通过使用特定于靶标蛋白质的蛋白质结合剂(通常是抗体)的结合事件间接测量您的目标。

 

这方面的例子包括传统的蛋白质印迹法,它允许蛋白质水平的基本可视化,并且是大多数实验室研究人员熟悉的技术。如果需要其他信息(如定位或细胞类型表达),可以使用更复杂的技术,如流式细胞术和 IHC/IF。当您的样本类型是免疫细胞的异质群体或由各种细胞类型(例如在组织中)组成时,这些特别有用,其中蛋白质的变化可能仅发生在特定细胞类型中。这些技术在许多情况下大放异彩,但也有一些折衷,例如较低的通量(蛋白质印迹法),并且在测量总体目标水平时不像其他技术那样定量(流式细胞术、IF、IHC)。

 

当您的主要目标是对大量样品(细胞/组织提取物、血清或其他生物流体)中的蛋白质进行严格灵敏的定量时,ELISA 等免疫测定法非常适合。虽然免疫测定有许多种口味,但夹心ELISA是实验室中常用的主要方法,通过在该靶标的不同表位特异性的2种抗体之间形成蛋白质“已糖化”的复合物,并使用酶结合物检测来测量蛋白质水平。ELISA 是一种常用的平台,因为它们运行简单且快速。ELISA 在筛选和剂量反应实验(化合物筛选、治疗化合物的抑制曲线、疾病进展期间或治疗干预后患者样本中的生物标志物测量)中真正发挥作用的地方正在运行大量样本以及直接和准确的定量(相对或绝对,如果与蛋白质标准配对)是必要的。ELISA 可以轻松处理大量样本,因为它们通常设置为 96 或 384 孔检测,但如果与机器人自动化配对,则可以提高通量。最重要的是,夹心 ELISA 被认为是定量的金标准——它们通常比其他技术(如蛋白质印迹法)更灵敏,动态范围更大,同时仍保持高特异性。这些好处确实伴随着权衡——夹心 ELISA 需要提供成对工作的高质量抗体,并且需要更多的时间和精力来制造、优化和验证。此外,传统的夹心 ELISA 不太适合高度多路复用的设置。尽管它们非常适合批量样品(生物流体、细胞/组织提取物)中的蛋白质定量,但如果还需要对特定细胞类型进行定位或定量,则您需要将其他方法纳入您的工作流程。

 

较新的 ELISA 类似检测技术可以利用传统 ELISA 中使用的抗体/抗体对,进一步增强传统 ELISA 的定量优势,同时增加功能,尽管这通常需要专门的设备和更复杂的设置。例如,检测方法的进步,例如无标记检测(表面等离子共振、不需要用酶或荧光团标记抗体的石墨烯传感器)和基于标记的检测(荧光团、基于 DNA 的检测、接近-诱导检测)以及替代的捕获抗体固定策略(基于珠子、点特异性)可以进一步提高灵敏度、动态范围、通量、测定速度和多路复用。

 

类似于 ELISA 的检测技术不断发展,更新的技术甚至朝着单细胞和多组学测量(蛋白质、RNA 和 DNA)的方向发展。无论您的 ELISA 格式多么简单或复杂,底线是所有这些仍然需要高度特异、灵敏且经过验证的抗体/抗体对作为检测的基础。

 

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