什么是 TR-FRET？一种用于药物发现的高通量、免洗、高灵敏度检测方法

如果您从事药物发现工作，您很可能持续面临着巨大压力，需要大规模地交付高质量数据，而且时间期限非常紧迫，几乎没有容错空间。高通量筛选、先导化合物确立到先导化合物优化，都要求检测方法灵敏、稳健，并且兼容 384 孔或 1536 孔板的自动化操作。

时间分辨荧光 (TRF) 福斯特共振能量转移 (TR‑FRET) 检测法已成为一种首选解决方案，这是因为它兼具高灵敏度和极低的背景噪音，同时还具备免洗、混合即读的便捷性、快速的检测周期（约 1-2 小时）以及低上样量（384 孔板中约 20 µL）。再加上其宽广的动态范围和在适合自动化的高通量筛选中表现出的可靠性能，TR-FRET 是一种在不牺牲数据质量的前提下扩大检测规模的强大方法。

Steven Mullenbrock 博士 分子检测组首席科学家

“一旦您建立了可靠的 TR-FRET 检测方法，在实验台上运行它会出奇地简单。但成功的秘诀在于拥有一套灵活的高质量抗体对和偶联物工具箱，为检测方法的开发奠定坚实的基础。”

在此，我们将介绍 TR-FRET 的概念及其工作原理，并阐述为何基于铕 (Eu) 的 TR-FRET 检测方法特别适用于高通量、自动化的药物发现检测。

TR‐FRET 是什么？基础知识和原理

TR-FRET 利用长寿命荧光基团（用于时间分辨测量），并将其与 FRET 原理相结合。FRET 是一种能量转移过程，即当处于激发态的供体荧光基团与受体荧光基团彼此靠近 (10-100 Å) 时，会将能量转移给受体荧光基团，如图 1 所示。正是这种对近距离接触的要求，使得 FRET 能够检测蛋白质水平、蛋白质间相互作用以及药物-蛋白质相互作用的变化——无论涉及的是同一蛋白质上的两个表位、受体-配体对，还是靶向蛋白质降解 (TPD) 过程中的靶标-E3 连接酶复合物。

图 1. 基于铕-红光受体的 TR-FRET 检测中的激发与发射示意图。当发生相互作用并产生 FRET 效应时，供体在约 620 nm 处发射，受体在约 665 nm 处发射。当无相互作用发生时，仅供体在约 620 nm 处发射。

TR-FRET 与传统 FRET 的不同之处在于所使用的供体类型以及信号的测量方式：

• 供体是一种长寿命荧光基团，通常是镧系元素，例如铕 (Eu or Eu³⁺) 或铒 (Tb)，而非传统的有机染料。
• 由于镧系供体发射的荧光可持续数毫秒，因此兼容 TR-FRET 的酶标仪可在激发后引入短暂的时间延迟（微秒级），从而仅测量长寿命信号。

短寿命荧光基团更容易受到样品自发荧光和杂散光直接激发受体的干扰，相比之下，时间门控检测则能选择性地捕获寿命较长的镧系元素发射光以及由 FRET 介导的受体发射光。

图 2. 时间门控 TR-FRET 检测。激发脉冲之后紧接着一段延时，在此期间背景荧光发生衰减。在选定的时间窗口内测量来自 TR-FRET 相互作用的长寿命供体和受体发射光，以提高信号背景比。

Eu³⁺ 和 Tb³⁺ 等镧系离子还展现出较大的斯托克斯位移，即最大激发波长与发射波长之间的差值，这使得酶标仪能够更清晰地将供体信号与受体信号分离。大的斯托克斯位移与时间门控检测相结合，显著提高了信号背景比，并能够在一个完全均相、免洗的工作流程中，对复杂的生物样品进行稳健测量。

“一旦建立了可靠的 TR-FRET 检测方法，在实验台上运行起来会出奇地快速简单，”CST 分子检测组首席科学家 Steven Mullenbrock 博士解释道，“但这一成功的秘诀在于拥有一个灵活的高质量匹配抗体对和偶联物工具箱，为 TR-FRET 检测方法的开发奠定坚实的基础。” 

供体：为何铕及其他镧系元素让 TR-FRET 如此强大

TR-FRET 中的供体分子通常是偶联了镧系元素的抗体、肽段或蛋白质。虽然镧系元素原子本身在激发后具有较长的衰减时间，但它们缺乏有效收集能量并将其转移给受体荧光基团的能力。因此，镧系元素被嵌入一个捕光笼状结构中，该结构通常由穴状化合物或螯合物形成，起到天线的作用，从而提高激发和发射效率。

众所周知，穴状化合物偶联物在广泛的 pH 值和检测条件下均比螯合物更为稳定，且能有效抵御金属解离，这有助于其在严苛的筛选环境中保持优异的性能。^1-4

“正是这种稳定性使得我们的 TR-FRET 工具箱能够专注于基于 Eu³⁺ 穴状化合物的供体——我们有很多现成的 Eu³⁺ 穴状化合物偶联抗体，并且已经过 TR-FRET 检测验证，”Mullenbrock 说道，“如果您的实验需要不同的选择，我们也可以从我们丰富的抗体产品组合中，为您制备 Eu³⁺ 螯合物偶联物或额外的 Eu³⁺ 穴状化合物偶联物。”

Eu³⁺ 穴状化合物偶联物可被 320-340 nm 的灯或激光激发，并在 615-620 nm 附近产生相对尖锐的发射光谱，这与常见的红移受体染料配合良好，如图 3 所示。

图 3. trFluor^TM 铕穴状化合物的荧光光谱查看器图像，显示激发光谱（虚线）和发射光谱（实线）。

受体：选择合适的红移配对伙伴

荧光受体分子通常是一种传统的荧光基团，其选择依据是供体发射光谱与受体激发光谱之间的重叠程度，该受体分子偶联在另一个抗体、肽段或蛋白质上。当供体与受体相互靠近时，供体的发射能量会激发受体，使该荧光基团在更高的波长处发出信号。 

当使用 Eu³⁺ 偶联供体时，受体染料应具有靠近 Eu³⁺ 发射峰（约 620 nm）的激发带，并且其发射光应充分红移，以便与供体发射光清晰分离。在实践中，基于 Eu³⁺ 的 TR-FRET 检测常使用 Alexa Fluor^® 647 或别藻蓝蛋白 (APC) 等“红光染料”作为受体。

总结：TR-FRET 检测的工作原理

无论具体的检测类型如何，TR-FRET 的原理都是相同的：将 Eu³⁺ 穴状化合物偶联的供体与荧光基团偶联的受体混合。供体受激发后，当供体与受体距离很近时，能量会转移至受体。需要使用与 TR-FRET 兼容的酶标仪来激发 Eu³⁺ 穴状化合物，并在延迟后同时测量供体和受体的发射光。然后报告比率信号（受体/供体），该信号可以校正孔间差异或微小的体积差异。

由于所有反应都在溶液中进行，TR-FRET 检测是真正的均相检测：您只需将试剂与样品混合、孵育并进行读数，无需添加洗涤步骤以去除未结合组分。这种均相特性正是 TR-FRET 如此契合高通量且易于自动化的工作流程的主要原因。

参考文献

1. Degorce F, Card A, Soh S, Trinquet E, Knapik GP, Xie B. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 2009;3:22-32. Published 2009 May 28. doi:10.2174/1875397300903010022

2. Mathis G. Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera. Clin Chem. 1993;39(9):1953-1959.

3. Maurel D, Comps-Agrar L, Brock C, et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 2008;5(6):561-567. doi:10.1038/nmeth.1213

4. Nørskov-Lauritsen L, Thomsen AR, Bräuner-Osborne H. G protein-coupled receptor signaling analysis using homogenous time-resolved Förster resonance energy transfer (HTRF^®) technology. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2554-2572. Published 2014 Feb 13. doi:10.3390/ijms15022554