解锁泛素的力量：靶向蛋白质降解背后的科学

泛素是一种体积小但功能强大的蛋白质，几乎参与所有的细胞信号转导通路，对调节基本细胞过程至关重要。一个或多个泛素蛋白的连接（即泛素化），可以靶向蛋白质进行降解，或调节其活性、定位或相互作用——这使得泛素成为蛋白质质量控制、信号转导以及新兴治疗策略（如靶向蛋白质降解，即TPD）的核心调节因子。

理解泛素信号如何被调控，对于推进 TPD 药物发现至关重要，这不仅有望开发出效力更强的药物，更能实现以往被认为是“不可成药”靶标的降解。 

泛素化通路：蛋白质如何被标记以进行降解

泛素化通过一个三步酶促过程被激活：

• 泛素激活： 首先，泛素被 E1 酶激活，形成硫酯键。

• 泛素结合： 激活的泛素被转移至泛素结合酶 E2。

• 泛素连接：最后，泛素通过 E3 泛素连接酶从 E2 转移到特定的底物上。

泛素分子与靶标蛋白的连接方式（即连接链或分支类型）以及磷酸化等翻译后修饰 (PTM)，都会显著影响泛素化的生物学功能和蛋白质底物的最终命运。蛋白质可以被单泛素化或多泛素化，其中多泛素链通过特定的赖氨酸残基形成（K48 和 K63 连接链最为丰富且研究最为广泛），或通过线性泛素链组装复合体 (LUBAC) 以头尾相接的方式形成。

• K48 分支的多泛素化可被蛋白酶体识别，通常导致蛋白质降解。
• K63 分支和线性泛素化通常调节与内吞作用、DNA 损伤控制和免疫应答相关的蛋白质支架功能和信号转导通路。

除 K48 和 K63 外，泛素还可通过其他赖氨酸（如 K11、K29、K33）形成链状结构及混合链，它们各自对应着多种细胞功能与结果。 

由于不同的连接模式通常对应不同的生物学结果（例如降解与信号转导），连接特异性抗体有助于推断泛素化对特定底物所产生的功能影响。当与串联泛素结合实体 (TUBE) 试剂配合使用时，这些连接链特异性抗体能够在特定实验中支持对多泛素化底物进行选择性富集和连接分辨检测。

通过磷酸化调控泛素

泛素本身也受到磷酸化的调控，这为其功能增添了另一层调节机制。其中特征最明确的事件之一，是线粒体损伤后激酶 PINK1 介导的泛素 Ser65 位点磷酸化。这在识别定位于线粒体的泛素化蛋白、并通过线粒体自噬途径将其清除的过程中起着关键作用。该过程对于维持线粒体健康至关重要，此通路的紊乱会导致帕金森病等疾病的发生。

使用 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit Monoclonal Antibody #62802（上图）、PINK1 (D8G3) Rabbit Monoclonal Antibody #6946（中图）或 GAPDH (D16H11) Rabbit Monoclonal Antibody #5174（下图），对未经处理或经过羰基氰化物 3-氯苯腙处理的 PC-3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。	使用 Pan-branch Ubiquitin TUBE-UBQLN1 (trFluor™ Europium Cryptate Conjugate #75130 和定制偶联的 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit Monoclonal Antibody #62802 (Alexa Fluor® 647 Conjugate)，对经缬氨霉素处理和未经处理的 293 细胞裂解物进行滴定，开展 TR-FRET 检测。图中显示了裂解液蛋白浓度与 TR-FRET 比值的关系。TR-FRET 检测在 384 孔白色板中进行，并使用激光激发 (337 nm) 在 BMG PHERAstar 上读取。

由于泛素 Ser65 位点的磷酸化与 PINK1-Parkin 通路的激活紧密偶联，因此它被广泛用作线粒体自噬的标记物。使用 CST 的磷酸泛素 (Ser65) 试剂等抗体，可通过蛋白质印迹或 ELISA+ 检测追踪细胞模型中 PINK1-Parkin 依赖性线粒体自噬，为监测线粒体质量控制提供了一种便捷的获取数据的方式。此类试剂能够精确监测这一重要的信号转导事件，而无需借助更复杂的蛋白质组学工作流程。

Targeted Protein Degradation: 将生物学转化为精准治疗

泛素化的降解功能现已被巧妙地用于创造靶向特定蛋白质进行降解 (TPD) 的治疗机遇。这一新兴技术利用化学诱导邻近 (CIP) 效应，将 E3 泛素连接酶与疾病相关目的蛋白连接起来，从而导致后者降解。目前主要有两种策略：

• PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）：PROTAC 是双功能分子，包含两个化学结合结构域：一个结合目的蛋白 (POI)，另一个结合 E3 泛素连接酶。通过将连接酶和靶标拉近，PROTAC 使得细胞自身的泛素化机制能够标记 POI，使其被蛋白酶体降解。

• 分子胶降解剂： 分子胶利用小分子稳定 E3 泛素连接酶与 POI 之间的相互作用，同样导致目的蛋白的泛素化和降解。

通过分子胶降解剂或 PROTAC 介导的泛素化，可为靶标蛋白打上标签，使其被蛋白酶体识别并降解。

尽管截至 2026 年初，尚无采用该方法的药物获批上市，但这一领域发展迅速，有望开发出疗效更强的药物，并有可能使那些因结合口袋较弱而曾被认为“不可成药”的靶标变成可成药。例如，突变的激酶（如 KRAS）、转录因子（如 STAT3）以及蛋白质支架和复合物等以往无法成药的靶标，现在都有可能通过 TPD 实现成药。目前的临床候选药物，如用于前列腺癌的雄激素受体降解剂，展示了 TPD 如何通过清除（而非仅仅阻断）疾病相关蛋白，来补充传统小分子抑制剂的不足。

一系列平台兼容、经应用验证的工具已应运而生，用于回答整个药物开发过程中关于邻近诱导 TPD 的关键问题。根据具体的研究问题，可以采用多种泛素化分析检测方法的组合，包括连接链特异性和磷酸化特异性抗体、基于 TUBE 的富集技术，或全蛋白质组范围的 K-ε-GG LC-MS 工作流程，这些方法在数据维度、覆盖深度与检测通量方面各有侧重。 

值得注意的是，由于基于 K-ε-GG 的富集检测的是胰蛋白酶消化后赖氨酸上残留的二甘氨酸残基，它能提供灵敏的泛素化位点水平覆盖，但无法区分单泛素化与多泛素化，也无法解析链的连接类型。分支特异性抗体有助于进行这种区分，但标准的泛素抗体可能无法有效捕获低化学计量比或瞬时泛素化的物种。而源自 UBQLN1 和 RAD23A 等泛素受体的 TUBE，可作为分子陷阱选择性富集多泛素化蛋白，同时排除游离泛素，从而提高下游分析的回收率和特异性。

要探索这些工具如何应用于 TPD 工作流程，例如监测靶标泛素化、通路激活以及在靶/脱靶效应，请参阅关于检测方法选择和基于 TUBE 检测方法的配套博文：

• 为靶向蛋白质降解研究选择正确的泛素化检测方法 

其他 TPD 资源

• 资源中心：近距离诱导靶向蛋白质降解工具

• 网络研讨会： 靶向蛋白质降解：控制和评估治疗靶点以推进肿瘤药物发现
  • 演讲嘉宾：Behnam Nabet 博士（弗雷德哈钦森癌症研究中心）和 Matthew Stokes 博士 (Cell Signaling Technology)

参考文献

• Eladl O. Molecular glues and PROTACs in targeted protein degradation: mechanisms, advances, and therapeutic potential. Biochem Pharmacol. 2025;242(Pt 3):117297. doi:10.1016/j.bcp.2025.117297
• Hjerpe R, Aillet F, Lopitz-Otsoa F, Lang V, England P, Rodriguez MS. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 2009;10(11):1250-1258. doi:10.1038/embor.2009.192