为靶向蛋白质降解研究选择正确的泛素化检测方法

在靶向蛋白质降解 (TPD) 药物发现过程中，确认靶标泛素化是表征其降解通路的关键一步。然而，对许多科学家而言，获得这些答案绝非易事。液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 是评估整体蛋白质泛素化最常用的方法，但 LC-MS 设备往往预约爆满，蛋白质组学工作流程可能耗时数周（甚至数月），而数据解读又增加了另一层复杂性。对于承受着项目推进压力的团队而言，这些瓶颈可能会在关键决策点拖慢进展速度。

无论您是在实验台前优化检测条件，还是在同时推进管线中的多个项目，面临的挑战都是相同的：如何不每次实验都依赖基于 LC-MS 的蛋白质组学进行，还能获得可量化、可用于决策的泛素化数据？

串联泛素结合实体 (Tandem-Repeated Ubiquitin-Binding Entities，TUBE) 是一种首次发现于 2009 年的重组技术，有助于克服仅使用抗体试剂进行泛素化研究时面临的灵敏度挑战，同时帮助团队避开 LC-MS 的瓶颈。通过将 TUBE 与连接链特异性、磷酸化特异性或靶标特异性抗体相结合，您可以构建出的定量检测方法，来回答诸如“我的靶标被泛素化了吗？”、“存在哪些连接链类型？”以及“泛素化如何随降解剂剂量和时间变化？”等问题。

本文概述了如何在蛋白质印迹法、ELISA+、TR-FRET 及其他工作流程中选择和使用基于 TUBEs 的试剂及泛素抗体，从而使您能够根据特定的 TPD 问题、通量需求和样品限制来匹配合适的检测方法。

什么是串联泛素结合实体 (TUBE)？

串联泛素结合实体 (TUBE) 是一种工程化蛋白，包含四个串联排列的泛素相关 (UBA) 结构域重复序列，从而对多泛素链具有极高的表观亲和力。在功能上，它们充当分子陷阱，能够高效捕获 K48 和 K63 分支的多泛素化蛋白，实现对单独使用标准泛素抗体可能漏检的泛素化事件进行灵敏检测。

虽然传统的泛素抗体可能难以有效免疫沉淀 (IP) 多种多泛素化物种，尤其是低丰度或高度分支的链，但 TUBE 由于使用了多个 UBA 结构域，提供了更高的表观亲和力和更高效的捕获能力。重要的是，TUBE 能选择性结合多泛素化蛋白而非游离泛素，从而提高了在复杂裂解液中对泛素化底物的检测特异性。当与连接特异性、磷酸化特异性及靶标特异性抗体结合使用时，与单独使用分支特异性或广谱泛素抗体进行免疫沉淀相比，这能转化为更强的信号和更好的泛素化蛋白回收率。

TUBE 还有助于在样品处理过程中保护所捕获的多泛素化蛋白免受去泛素化酶活性的影响，从而保存泛素链以用于下游分析。

UBQLN1 与 RAD23A TUBE：有何区别？

TUBE 试剂来源于两种特征明确的泛素结合蛋白 UBQLN1 和 RAD23A 的泛素受体结构域。每种 TUBE 变体均能结合 K48 和 K63 连接的多泛素链，从而实现对降解性及非降解性泛素化事件的广泛捕获。这种广谱分支结合特性使得 TUBE 在具体的连接模式未知或可能随处理条件而变化时尤为有用。

为展示源自 UBQLN1 和 RAD23A 的 TUBE 的独特结合特性，CST 的研究人员进行了一项全蛋白质谱实验，分别使用广谱分支泛素 TUBE-RAD23A 试剂和广谱分支泛素 TUBE-UBQLN1 试剂捕获多泛素化蛋白。 

Gary Kasof，产品设计与战略总监

“虽然基于 UBQLN1 和 RAD23A 的 TUBE 均能结合大量多泛素化蛋白，但可能存在靶标特异性偏好。 根据您系统中的底物和连接模式，同时使用两者可以发挥互补性能。”

每次捕获后检测到的蛋白质总数显示，尽管大多数泛素化蛋白为两种 TUBE 类型所共有（这与广谱、分支泛素富集的结果一致），但每种试剂也分别下拉出了一组独特的、似乎仅能被基于 UBQLN1 或 RAD23A 的 TUBE 特异性富集的蛋白质亚群。

图 1. 使用 Pan‑branch Ubiquitin TUBE‑RAD23A (Magnetic Bead Conjugate) #64334 或 Pan‑branch Ubiquitin TUBE‑UBQLN1 (Magnetic Bead Conjugate) #43658 对经或不经多种 DUB 抑制剂处理的 HCT 116 细胞中捕获的多泛素化蛋白进行全蛋白质谱分析。大多数蛋白可被两种 TUBE 捕获，表明其具有广泛的广谱分支富集能力，但每种 TUBE 也回收了大量明显独特的蛋白质，这表明在复杂样品中联合使用两种试剂可以更全面地覆盖泛素化底物。

这些数据表明，虽然这两种工具都能深度覆盖多泛素化物种，但联合使用可能提供更全面的泛素化事件覆盖，特别是在复杂样品中或当连接模式因靶标和处理方式而异时。

在检测中联合配对试剂使用 TUBE

除了简单的亲和捕获实验，TUBE 还可与第二种检测试剂配对用于检测，其中一种负责捕获泛素化物种，另一种则报告特定蛋白质或翻译后修饰 (PTM)。在典型设置中，TUBE 首先富集多泛素化蛋白，然后使用靶标特异性抗体（例如，针对您的 PROTAC 靶标或招募的 E3 连接酶）检测该蛋白是否在被捕获的物种中，从而将通用的泛素捕获转变为针对靶标的数据。在降解剂发现过程中，这种模块化的捕获与检测模式使团队能够探究特定 PROTAC 或分子胶是否与其靶标结合并驱动通路相关的泛素化事件。

由于捕获和检测是模块化的，这些基于配对的检测方法能够很好地适用于时间过程研究、剂量反应研究以及跨多种细胞模型和降解剂类型的组合筛选。

用于亲和捕获实验的 TUBE 偶联磁珠

偶联了 TUBE 的磁珠或琼脂糖凝胶能够直接从细胞或组织裂解液中高效富集多泛素化蛋白，随后通过蛋白质印迹法进行下游特异性底物检测。与单独使用泛素抗体或靶标抗体相比，广谱分支 TUBE-UBQLN1 和 TUBE-RAD23A 磁珠偶联物可改善对低丰度、分支型或瞬时泛素化物种的捕获，这些物种在仅使用抗体的工作流程中可能低于检测阈值。

当您希望通过蛋白质印迹法确认特定靶标的泛素化，或希望在蛋白质组学 LC-MS 分析前将 TUBE 用作捕获试剂时，这种方法非常有用。通过这种方式，磁珠偶联 TUBE 可以富集相关的多泛素化底物，用于条带水平验证或更深入的、位点解析的蛋白质组学分析，从而与其他泛素化工具形成互补。

例如，已知 TNF 等炎症刺激会增加 RIPK1 等信号转导蛋白的泛素化。TUBE 偶联磁珠可以高效捕获这些多泛素化蛋白（图 3），从而通过免疫印迹实现对 RIPK1 及相关通路组分的下游检测。在此类实验中，TUBE 捕获多泛素化底物，随后在蛋白质印迹法中使用靶标特异性抗体来确认每种条件下哪些蛋白发生了泛素化。

图 2. 左图：用磁珠偶联 TUBE 分离多泛素化蛋白，然后用 Ubiquitin (E4I2J) Rabbit Monoclonal Antibody #43124 进行检测。该抗体不与游离泛素结合。右图：使用磁珠偶联 TUBE 从 TNF 处理 (+) 和未处理的细胞中，通过 RIP (D94C12) Rabbit Monoclonal Antibody #3493 分离靶标特异性多泛素。

由于在 PROTAC 研究中，靶标分子在泛素化后可能被快速降解，因此在 TUBE 富集和检测前，通常使用蛋白酶体抑制剂进行短时间预处理以稳定泛素化中间体，从而提高捕获瞬时物种的机会。

用于类 ELISA 检测和 TR-FRET 检测的生物素或铕偶联 TUBE 

生物素化或铕偶联的 TUBE 可在更高通量、基于微孔板的检测形式中实现定量检测，非常适合筛选大量样品以及跨样品的动力学研究。在类 ELISA 检测设置中，生物素化 TUBE 捕获多泛素化物种，而基于链霉亲和素的检测以及靶标或 PTM 特异性抗体则提供关于目的蛋白或修饰的数据。

例如，CST 的生物素化 Pan-branch Ubiquitin TUBE-RAD23A #58553 可在夹心式类 ELISA 检测中用作检测试剂，以灵敏地定量多种样品和条件下的泛素化蛋白。通过将生物素兼容的 TUBE 与针对泛素 Ser65 位点的磷酸化特异性抗体配对，研究人员可以监测与线粒体自噬相关的信号转导事件，因为 PINK1 依赖的泛素 Ser65 磷酸化是 Parkin 介导的线粒体自噬中一个公认的标记物和激活因子。

在下面的示例图中，生物素和铕偶联的 TUBE 被用于类 ELISA 检测配置中，以定量通路特异性泛素化事件，展示了相同的捕获试剂如何既能支持靶向筛选，也能支持更广泛的筛选应用。

图 3.使用 Pan-branch Ubiquitin TUBE-UBQLN1 Assay Kit (Anti-rabbit IgG Secondary) #17452，以 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit Monoclonal Antibody (1 µg/mL) 作为检测抗体，进行夹心式 ELISA 检测。该配对夹心式 ELISA 用于检测缬氨霉素处理的 293 细胞中磷酸化泛素 (Ser65) 的刺激情况。左图显示了未经处理和缬氨霉素处理的 293 细胞裂解液蛋白浓度与 450 nm 处吸光度的关系。右图显示了使用磷酸化泛素 (Ser65) 抗体（左图）和泛素抗体（右图）进行的相应蛋白质印迹检测结果。将 293 个细胞不进行处理，或在 37°C 下用缬氨霉素 (1 µM) 处理 24 小时，然后裂解。	图 4.使用 Pan-branch Ubiquitin TUBE-UBQLN1 Assay Kit (Anti-rabbit IgG Secondary) #17452 ，以 RIP (E8S7U) Rabbit Monoclonal Antibody (2 μg/mL) 作为检测抗体，进行夹心式 ELISA 检测。该配对夹心式 ELISA 被用于检测经 TNF-α处理的 HeLa 细胞中泛素化 RIP 蛋白水平的升高。图中显示了未经处理和 TNF-α 处理的 HeLa 细胞裂解液蛋白浓度与 450 nm 处吸光度的关系。HeLa 细胞未经处理或用 TNF-α（20 ng/mL）处理 5 分钟后进行裂解。

什么时候仍需使用 LC-MS

如果您的目标是进行无偏倚的全蛋白质组泛素化位点图谱绘制，或者需要了解降解剂的在靶及脱靶泛素化网络，LC-MS 仍然是首选方法。

在典型的工作流程中，使用能够识别泛素（或泛素样修饰物）剪切后赖氨酸上残留的 K-ε-GG 残基的抗体来富集胰蛋白酶消化的肽。虽然这种方法无法区分单泛素化与多泛素化，也无法解析链的连接类型，但它提供了一种灵敏的策略，用于识别全局泛素化位点并量化整个蛋白质组的变化。残基基序抗体（例如 PTMScan^® HS Ubiquitin/SUMO Remnant Motif (K-epsilon-GG) Kit #59322）也可被更针对性地用于监测 PROTAC 处理后特定靶标的泛素化，并补充总蛋白质组学，以用于深入的作用机制研究。

研究海报：优化泛素化残留 DIA 蛋白质组学技术助力 PROTAC 高通量筛选

在实践中，许多 TPD 团队使用基于 TUBE 的检测方法进行假设驱动问题的研究和筛选，仅将 K-ε-GG LC-MS 用于少数需要位点分辨率水平和全局网络分析的实验。

选择正确的泛素化检测方法

将基于磁珠和基于微孔板的 TUBE 形式相结合，为 TPD 团队提供了一个灵活的工具箱：通过下拉检测结合蛋白质印迹法进行机制性的条带水平验证，以及采用类 ELISA 或 TR-FRET 检测配置，实现对跨多个剂量、时间点或细胞系的泛素化进行更高通量的定量。为研究选择正确的检测方法取决于通量、特异性以及所需洞察的类型。

下表将常见的 TPD 问题与使用 TUBE、抗体和 LC-MS 的实用检测设计进行了对应。 

其他 TPD 资源

• 资源中心：近距离诱导靶向蛋白质降解工具
• 网络研讨会： 靶向蛋白质降解：控制和评估治疗靶点以推进肿瘤药物发现
  • 演讲嘉宾：Behnam Nabet 博士（弗雷德哈钦森癌症研究中心）和 Matthew Stokes 博士 (Cell Signaling Technology)

参考文献

• Eladl O. Molecular glues and PROTACs in targeted protein degradation: mechanisms, advances, and therapeutic potential. Biochem Pharmacol. 2025;242(Pt 3):117297. doi:10.1016/j.bcp.2025.117297
• Hjerpe R, Aillet F, Lopitz-Otsoa F, Lang V, England P, Rodriguez MS. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 2009;10(11):1250-1258. doi:10.1038/embor.2009.192
• Snyder LB, Neklesa TK, Willard RR, et al. Preclinical Evaluation of Bavdegalutamide (ARV-110), a Novel PROteolysis TArgeting Chimera Androgen Receptor Degrader. Mol Cancer Ther. 2025;24(4):511-522. doi:10.1158/1535-7163.MCT-23-0655