实验方案的精心计划和微调对于确保获得清晰、可判定的科学结果至关重要。对于免疫组织化学 (IHC) 研究而言尤其如此，在该过程中，通常为期数天的每个步骤（从组织制备到染色形成）都会显著影响最终结果和分析。通常，需要同时检查多种抗原来解决特定的科学问题，这进一步使 IHC 方案的开发复杂化。为了实现可靠的结果，了解优化针对不同靶点的 IHC 需要哪些步骤是至关重要的。那么，这些步骤是什么？
在概述双重染色的指南之前，让我们首先回顾一下免疫组织化学的基本原理。长期以来，IHC 一直被用作医学上的重要诊断工具以及基础研究中的研究工具。IHC 是一种“信息丰富”的程序，它使科学家不仅可以确定是否存在感兴趣的靶点，还可以在样品的自然组织学背景下查看它在哪里表达。通过对多种抗原的染色进行分层，IHC 可为潜在的生物学过程提供新颖见解或区分正常状态和病理状态。
IHC 通过利用特定的抗体-抗原相互作用配合检测方法来产生可通过显微镜观察的反应来运行。感兴趣的细胞蛋白质是研究中最常见的抗原，但碳水化合物（在某些情况下）和核酸还可以通过 IHC 检查。
除了组织制备本身以外，任何 IHC 实验中最重要的组成是一抗，因为它直接影响 IHC 反应的特异性。IHC 中使用的一抗有两种形式：多克隆和单克隆。多克隆是指在同一宿主中产生的可识别靶抗原多个区域或表位的抗体的集合。另一方面，单克隆是指与一个特定表位结合的单一抗体。可以通过采用所需抗原免疫多种宿主（从兔到山羊），然后直接从血清中纯化或分离用于杂交瘤发生、可产生抗体的 B 细胞来生产每种抗体。
抗体-抗原相互作用可以通过多种方法检测。一种选择是将荧光标签或显色酶（如辣根过氧化物酶(HRP)）直接偶联至一抗。但是，更常见的方法是使用标记的二抗，该抗体以种属特异性方式识别并结合一抗主链或重链。与直接偶联相比，二抗的使用具有许多优势，包括信号放大以及将它们与多种一抗结合使用的灵活性，可节省成本。最后，独立的显色或荧光标签可用于同一组织样品中的几对一抗/二抗的多色检测。
这使我们回到最初的问题：优化 IHC 同时检测两种抗原的必要步骤是什么？首先，应该选择经过验证的针对目标靶点的一抗（理想情况下是在单独的宿主种属中产生），并与种属特异性的二抗结合进行检测。该一般规则消除了在染色过程中对交叉反应的担忧。接下来，必须并行测试每种一抗的染色参数。这包括确定适当的抗体浓度、孵育时间和温度以及色原配对，以产生具有最强特异性的结果，同时将背景染色降至最低。一旦确定了单个抗体的条件，就必须评估染色剂显影的最佳顺序，以解决色原反应性的差异。最后，应将完成的双重染色的结果与初始的单一染色测试进行比较。如有必要，应调整色原的生成时间，以实现信号之间的平衡。这些步骤可适用于任何数量的靶抗原和组织样品，其使用可确保对 IHC 双重染色最终判定的把握。
有关此过程的更多详细信息，我们建议您参考我们最近的应用说明：优化免疫组织化学双重染色以可视化并了解 EMT 过程中的蛋白共表达。