使用放射性标记磷酸化成像对未绘制成图的生物信号转导通路进行了早期探索。开发磷酸化特异性抗体来检测和定量蛋白磷酸化使研究人员的工作更容易（需要处理的 32P 废物更少），但解释从这些实验中获得的数据需要注意其伴随的一些注意事项。
检出蛋白质磷酸化修饰
级联作用激酶和反作用磷酸酶的平衡决定何时何地分别通过添加和移除磷酰基团来传播信号。首先在丝氨酸/苏氨酸和组氨酸/天冬氨酸残基处观察到蛋白质磷酸化修饰，并且随后发现酪氨酸磷酸化。这些蛋白质修饰在巨大、相互连接的网络中蛋白质间中继信息，并且触及几乎每个重要的生物学功能，从细胞周期到代谢、从神经系统功能到免疫应答以及从组织发育到癌症。
为了跟踪信号，您需要了解您的靶标蛋白的磷酸化状态。识别磷酸化状态下肽基序的抗体是蛋白质印迹法 (WB) 和其他应用中宝贵的研究工具。这些抗体的范围从宽泛识别许多蛋白质中磷酸化（例如磷酰-酪氨酸）的抗体，到通过邻近残基识别已确定（简并程度不定）的 PTM 基序的抗体，到对特定肽中 PTM 有特异性的抗体。对大多数做出信号转导假说的科学家而言，肽特异性磷蛋白抗体是必选工具（如果可获得）。
在蛋白印迹实验中使用磷蛋白抗体时，必须记住这些修饰的罕见性，了解磷酸肽（磷酸酯）键的易断性，明白存在潜在磷酸酶造成虚假去磷酸化的风险。Cavalier 实验室操作规范会让你难以检测到磷蛋白，无论是通过去掉磷酸基（磷酸酶未被抑制）、蛋白降解（蛋白酶未被抑制），还是通过降低抗体检测的有效性。
在蛋白质印迹法中使用磷蛋白抗体的注意事项：
- 为了确保您的靶标磷蛋白仍磷酸化且未降解，在裂解缓冲液中添加磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（参见 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872）。您可能还需要考虑激酶抑制剂 1。
- 快速操作、保持冷却并超声处理，以获得细胞总裂解物（参见蛋白质印迹法实验步骤）。组织取得和处理速度、样品冷却和彻底分解对最大限度降低磷酸酶/蛋白酶活性和对保留您的信号至关重要 1-5。
- 注意 pH。尽管磷酸化丝氨酸、磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸键在非生理性 pH 下很稳定，但对于某些抗体，pH 值变化可能会对抗体检测产生不良影响。此外，如果电泳或转移缓冲液中的 pH 值出现偏离，则还可能对电泳分辨率和膜转移产生不良影响。
- 我们建议在引入抗体之前，使用 1X TBS、0.1% Tween 20 中的 5% Nonfat Dry Milk #9999 来阻断膜。我们没有看到与乳蛋白质（包括酪蛋白）的背景或交叉反应。就磷酸酶活性而言，巴氏杀菌法杀灭乳中的所有碱性磷酸酶活性。
- 查看产品网页/数据表，以了解建议的抗体稀释度。注意，使用脱脂奶粉阻断膜时，磷酸化特异性抗体通常会被稀释，并与膜放入 5% BSA 中孵育。
- 在洗涤/孵育缓冲液中使用 TBS-T，而非 PBS-T，因为磷酸离子可能造成干扰。*
- 如果计划剥离和再检测印迹物，则首先请探测磷蛋白，因为剥离过程往往导致磷蛋白抗原丢失/降解。由于抗原丰度可能低，我们建议在 4°C 与抗磷蛋白一抗孵育过夜（参见蛋白质印迹法解疑指南）。随后可以将印迹物剥离并使用抗总蛋白的抗体再检测，总蛋白充当上样/转移对照。
- 多重荧光报告（参见荧光蛋白质印迹实验步骤）可以允许同时测量总蛋白和磷蛋白，前提是您有成像能力。
- 我们建议使用阳性对照确认检出的条带是否磷酸化。还可以使用特异性激活剂和抑制剂操纵信号转导蛋白激活的用途或以磷酸化表位肽对比非磷酸化表位肽比较阻断。磷酸酶处理通常用作阴性对照以弥补其他实验性扰动。
- 磷蛋白往往为化学计量低丰度。通过免疫沉淀浓缩抗原可以并且应该能验证无效结果。
最后，如果所有实验性细节均优化，您应该可以一次在至少一个磷酸化位点检出那种难找到的磷蛋白。然而，也可能存在多个磷酸化位点，从而导致额外层面的复杂性。那么，可能是时候前往您的本地质谱核心机构了，或致电 CST 科学家使用我们的 PTMScan® 服务。
*您可能想知道其他实验步骤（即免疫荧光法和流式细胞术实验步骤）中 PBS 的用途。在这些实验步骤中，大分子与醛交联，并且三羟甲基氨基甲烷（TBS 的组分）中存在的伯胺可能有干扰，从而使得 PBS 有利。WB 中 PBS 对比 TBS 的价值历来已有些争议，并且可能有抗体/表位专属性。
选择参考文献：
- V. Espina 等人, A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol Cell Proteomics 7, 1998-2018 (2008).
- K. A. David 等人, Surgical procedures and postsurgical tissue processing significantly affect expression of genes and EGFR-pathway proteins in colorectal cancer tissue. Oncotarget 5, 11017-11028 (2014).
- A. S. Gajadhar 等人, Phosphotyrosine signaling analysis in human tumors is confounded by systemic ischemia-driven artifacts and intra-specimen heterogeneity. Cancer Res 75, 1495-1503 (2015).
- S. Gundisch 等人, Critical roles of specimen type and temperature before and during fixation in the detection of phosphoproteins in breast cancer tissues. Lab Invest 95, 561-571 (2015).
- A. P. Theiss, D. Chafin, D. R. Bauer, T. M. Grogan, G. S. Baird, Immunohistochemistry of colorectal cancer biomarker phosphorylation requires controlled tissue fixation. PLoS One 9, e113608 (2014).