随着人口的老龄化，神经退行性疾病和痴呆症的病例预计会增加，但阿尔茨海默病 (AD) 和帕金森病 (PD) 等疾病无法治愈。制定有效的治疗策略需要更深入地了解与这些神经退行性疾病的病因有关的不同细胞类型，包括不同细胞类型如何相互作用。就像所有事情一样，背景很重要！
获得这些见解的一种方法是使用多重空间分析技术。事实证明，这些方法对于肿瘤学研究非常有价值，它们能够绘制肿瘤微环境 (TME) 中的蛋白质和转录本，从而有助于确定细胞动态如何影响临床结果。然而，尽管大脑的多重空间分析对于神经退行性研究具有类似的前景——例如通过表征 AD 病理特征周围的细胞，如淀粉样蛋白-β (Aβ) 斑块和神经原纤维缠结 (NFT)——但它尚未发挥其全部潜力。
成年人阿尔茨海默病患者大脑的多重空间分析显示，含磷酸化 tau 的神经原纤维缠结和 Aβ 斑块显著增加。图片来自海报“使用多重成像对阿尔茨海默病患者脑组织进行空间蛋白质组学分析”。
神经退行性疾病研究人员面临的一个独特障碍源于样本材料的性质，对于神经退行性疾病研究来说，样本材料尤其难以获得，并且对多重空间分析带来了若干挑战。首先，尽管使用人类脑组织可直接询问疾病状态，但与小鼠或基于细胞的模型不同，大多数人类脑组织样本都采用福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE)，而小鼠样本通常是冷冻的。这意味着不能总是使用相同的抗体来染色两种样品类型，从而给进行比较带来困难。此外，使用 FFPE 组织历来会使进行一系列单重显色测量的研究人员面临种种限制，这既费时又费力。由于脂褐素积累而产生的自发荧光，以及缺乏具备足够特异性和灵敏度以确保准确染色的经验证抗体，引发了进一步的问题。
本文中，我们将重点介绍一些免疫组织化学 (IHC) 染色方法，并特别关注 FFPE 处理的组织，它们可用于脑组织中蛋白质的多重检测。我们还研究了 Leica Microsystems 的 Cell DIVE 多重成像解决方案如何与我们经 IF/IHC 验证的抗体结合，对 AD 脑样本进行空间和分子表征。
为什么空间分析对于理解人类大脑很重要？
尽管流式细胞术和单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 等单细胞分析技术被广泛用于表征生物样本，但它们无法揭示天然组织环境中不同细胞类型的位置。这可能会导致遗漏有价值的信息，因为细胞相互作用往往是疾病病因的基础。
例如，在大脑中，小胶质细胞和星形胶质细胞对于维持细胞稳态、免疫应答、清除细胞碎片、隔离或修复毒性损伤以及维持血脑屏障等功能至关重要。然而，它们的作用极其复杂，这些细胞类型可以表现出双重性质，有时被描述为类似于“双重人格”。在正常情况下，小胶质细胞和星形胶质细胞会保护和支持神经健康，但在疾病或损伤下，它们可能通过慢性炎症、神经退化或抑制恢复而造成伤害。此外，神经胶质细胞（特别是小胶质细胞）在遗传上与神经退行性疾病相关，这表明这些细胞可能在疾病病因中发挥直接和间接的作用。探究这些神经胶质细胞表现出的空间和时间上不同的激活模式，并识别反映不同功能群体的分子特征，可能会发现治疗 AD 和 PD 等神经系统疾病的新方法。1
因此，空间分析技术对于研究细胞动力学至关重要。它们使研究人员能够从提出诸如“每种细胞类型有多少？”之类的基本问题，转向进行更复杂的分析，例如“细胞在疾病条件下如何适应，以直接减缓或加速疾病进展？”和“Aβ 斑块和 NFT 等病理标记如何驱动细胞反应？”
最终，能够解答日益复杂的问题的方法可以帮助指导制定有效的治疗策略。
空间蛋白质组学有哪些优势？
与其他形式的空间分析（如空间转录组学和基因组学）相比，空间蛋白质组学的一个主要优势是它能够提供对细胞功能的洞察。这是因为，与 mRNA 和 DNA 不同，蛋白质可以直接控制细胞行为。尽管已经鉴定了各种疾病状态的 mRNA 特征，但它们不一定与蛋白质表达相关，这意味着需要仔细验证才能正确解释转录组学数据。
空间蛋白质组学还可以研究在神经退行性疾病中经常失调的翻译后修饰 (PTM)。例如，已知微管相关蛋白 tau 在 AD 患者脑中过度磷酸化，从而导致 NFT 中形成细胞毒性 tau 聚集体。相比之下，一种鲜为人知的 tau PTM，称为 O-糖基化 (O-GlcNAc)，被认为可以减弱 tau 过度磷酸化，因此可以为 AD 患者提供治疗益处。2
用于研究脑组织样本的抗体选择
在使用珍贵的脑组织样本生成空间蛋白质组学数据时，选择已经过验证可用于相应应用的抗体至关重要。一个常见的错误是，假设已验证可用于 FFPE 组织 IHC 染色的抗体也适用于冷冻组织样本，但事实往往并非如此。当使用 FFPE 组织时，必须严格验证抗体是否适用于此类样本，因为严苛的处理步骤（例如甲醛固定、脱蜡和抗原修复）可能会导致表位损伤。
在 CST，我们在开发和测试抗体时遵循严格的验证原则。这意味着根据特定应用和实验步骤生成验证数据，因为我们在开发高质量抗体的 25 年历程中早就了解到，抗体在一种应用中的性能并不能保证在另一种应用中表现出同样的性能。除了大量已经验证可用于新鲜冷冻组织的抗体外，我们还提供 800 多种经验证可用于 FFPE 组织的抗体。
下表列出了我们针对 AD 生物标记物和其他神经系统疾病提供的一些关键抗体，以及它们经过验证可用于的组织类型的信息：
您还可以浏览我们用 FFPE 组织或冷冻组织进行 IHC 验证的完整抗体目录。
空间蛋白质组学方法
一旦您选择了与 FFPE 兼容的抗体，您就可以在越来越多的支持空间蛋白质组学的方法中使用它们。以下使用 FFPE 脑组织的方法在复杂性和能够测量的标记物数量方面有所不同。CST 支持的方法包括：
- Leica Cell DIVE：使用经 Cell DIVE 验证的 CST 抗体，用多达四种荧光标记抗体连续数轮对 FFPE 组织进行染色，并且在循环之间使用温和的化学染料灭活过程。
- 传统的 IHC 直接检测：荧光团标记的一抗用于直接检测，比间接检测涉及的实验步骤更少，并避免了二抗交叉反应的风险。
- 多种物种的多重分析：来自不同宿主物种（例如小鼠、兔、山羊）的一抗与物种特异性的二抗结合使用，每种二抗都与独特的荧光团偶联，从而可以在单次染色中同时检测三到五个靶标。
- SignalStar™ Multiplex IHC：SignalStar 技术可在 FFPE 组织中同时扩增多种生物标记物，具有高灵敏度和特异性。寡核苷酸偶联抗体可同时结合多达八种分析物，然后带有荧光染料的互补寡核苷酸可放大信号以实现靶标检测。
下面的研究海报详细介绍了如何使用 Leica Cell DIVE 在 AD 大脑中 Aβ 和 tau 表达的背景下在空间上定义细胞群，例如星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元，以及通过计算检查突触过程。了解更多信息并下载海报：
您还可以在以下博客中找到有关多重分析方法的更多信息：
神经退行性疾病研究的未来挑战
随着研究人员对神经退行性疾病的了解不断加深，能够对大脑进行空间分析的方法也必须与时俱进。尽管抗体已经显示出在描述 AD 和其他神经退行性疾病的细胞动力学方面的广泛效用，但未来也将面临诸多挑战，例如将可以同时检测到的蛋白质数量增加到数十甚至数百个靶标，为新发现的生物标记物生成抗体产品，以及开发更复杂的工具和技术以用于在疾病背景下对细胞进行多组学分析。
选择以下参考文献
- Wu Y, Eisel ULM. Microglia-Astrocyte Communication in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 2023;95(3):785-803. doi:10.3233/JAD-230199
- Zhu Y, Shan X, Yuzwa SA, Vocadlo DJ. The emerging link between O-GlcNAc and Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014;289(50):34472-34481. doi:10.1074/jbc.R114.601351
24-NDT-91551
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