进行免疫荧光法 (IF) 时，通常用多种抗体和/或染料进行多重检测，以生成与其他标志物相关的目的蛋白的信息。在提交给 IF 技术支持团队的所有推荐请求中，提到的最受欢迎标记物是亚细胞标记物。
先说重要的：什么是亚细胞标记物？亚细胞标志物是针对细胞内部细胞器特有组分的高亲和力试剂，这些试剂可以通过提供不同细胞器的实体特征与空间特征的清晰视图来实现您的研究。在您的下一次免疫荧光实验中纳入亚细胞标记物的原因众多 — 研究专化细胞器特有性功能、借助细胞器健康状况评估药物效果或检查敲除细胞的整体变化。
您可能想要在实验中对目的蛋白使用特异性试剂，还想要使用一种试剂确定亚细胞定位。然而，并非所有试剂都普遍兼容。取决于模式物种和染色实验步骤，试剂的表现可能有差异。本指南旨在帮助您找到适合您实验需求的亚细胞标志物。
为了本次实验的目的，我们重点关注了五个主要的亚细胞定位：细胞骨架、线粒体、内质网、高尔基体和核包膜。
注意：这里已经省略几个细胞定位，因为它们具有非常特异的标记物（例如，带 Rab5 的早期内体或带 PCM1 的中心粒），或者因为可获得更快方法来标记这些定位（例如，核染料如DAPI #4083 和 Propidium Iodide #4087）。
用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961、Neurogranin #79519 和 S6 #5548 染色的小鼠视网膜
在这项分析中仅考虑普遍存在的标志物。使用 Cell Signaling Technology 用于免疫荧光实验的三个主要工作流程（甲醛固定加 Triton™ X-100 透化、甲醛固定加甲醇透化，以及甲醇固定），在人细胞、小鼠细胞和大鼠细胞中测试本实验中评估的试剂。
本着为指定实验步骤或物种确定最佳标志物的目标，我们已使用以下两个标准在指定定位内比较多种抗体，评估实验步骤和物种性能：特异性和信号强度。跨物种和实验步骤的性能已针对定位内部每个类别标的性能最佳者归一化，并依据 0至100 的量表评估。这允许我们比较雷达图中的多个变量（如比较饮料性状的下图所示）。
为避免在具体实验步骤或物种中推荐产生非特异性模式的产品（例如，用线粒体标志物进行核仁标记），如果观察到非特异性模式，将该产品相对于该类别给予 0。
出于这项试验的目的，在 96 孔板的单孔中一式三份测试按推荐稀释度于 100 uL 抗体稀释剂中稀释的每种抗体。一抗在 4°C 孵育过夜。使用 1:500 稀释的宿主适用性 Alexa Fluor® 488 conjugated secondary (Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 或 Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408) 抗体标记一抗。在室温避光孵育二抗一小时。通过高内涵分析法分析96 孔板，包括生成 MFI 数据的激光扫描图像细胞仪和生成 200 倍DAPI 图像与 488 信道图像的自动成像仪。
使用雷达图遍历每次亚细胞定位比较产品性能，这允许我们确定每个类别的最佳表现。虽然在本报告末尾可提供所有雷达图表，但此处突显关于每个定位过程的最佳表现者的详情。
使用细胞骨架标志物时，通过使用鬼笔环肽接合物（一种与纤丝状肌动蛋白紧密结合的鬼笔毒素）获得了最大的实验灵活性。因为这是一种非抗体标记方法，故而允许您为其他标志物保留宿主物种。鬼笔环肽有一个使用缺点 — 它不相容于甲醇透化或固定。
如果实验中需用甲醇，则α-Tubulin (DM1A) Mouse mAb #3873 在甲醇处理的样品中提供稳健信号。
谨记，与肌动蛋白（微丝）相比，微管蛋白标示细胞骨架的不同成分（微管）。取决于细胞类型，细胞骨架的第三种组分 — 中间丝 — 具有不同的蛋白质，因此不能纳入这个实验。
我们发现高尔基体标记物y有利于甲醛固定加 Triton™ X-100 透化。但是，如果您处理人样品，GM130 (D6B1) XP® Rabbit mAb #12480 具有很大的实验步骤灵活性。
只要包括甲醛固定，RCAS1 (D2B6N) XP® Rabbit mAb #12290 就在多个物种中发挥作用。
我们通常建议在处理 ER 特异性蛋白质时测试甲醛固定或甲醛固定加甲醇透化。但是，在这个实验中，PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501 配合所有受测实验步骤和物种均表现良好。
Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb #12238 与单独的甲醛固定不相容，需要甲醇透化或甲醇固定。
有许多可用的线粒体标志物。在 Cell Signaling Technology 内部，首选的线粒体标志物是 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318，因为它与许多物种和实验步骤相容。AIF Antibody #4642 在信号方面略胜于 #5318；但是，我们内部更喜欢使用 XP® 单克隆抗体。
在需要甲醇固定且物种为人类或大鼠的情况下，COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850 可能比 AIF 抗体表现更好。
在处理小鼠细胞时，SDHA (D6J9M) XP® Rabbit mAb #11998 在甲醇透化的样品中表现略好于 AIF 抗体。
对于核包膜标志物，有一个明确的赢家。Lamin A/C (4C11) Mouse mAb #4777 在所有物种和大多数实验步骤中均有效，并提供清晰明显的信号，后者随甲醇固定略减弱。
上面我们讨论了用于每个亚细胞定位的最佳表现者中某些者。
如同往常，实验成功的最重要因素是小心处理样品。在固定之前考虑细胞的健康状况和汇合度，因为这些因素会影响您的实验。确保您的样品充分固定，并避免让样品干透，因为这会不利影响免疫荧光实验。