用于免疫荧光法的亚细胞标志物选择

在进行免疫荧光 (IF) 实验时，研究人员经常使用多种抗体和荧光染料来分析他们的目的蛋白与其他细胞成分的关系。在提交给 IF 技术支持团队的所有请求中，最常被提到的标记物就是亚细胞标记物。

为了帮助您在免疫荧光实验中获得最佳特异性和信号强度，本博客根据所用的实验步骤，详细介绍了推荐用于识别亚细胞成分的 CST 抗体。

什么是免疫荧光中的亚细胞标记物？ 

亚细胞标记物是一类高亲和力试剂，专门靶向细胞内的特定细胞器组分。这些标记物对于揭示目的蛋白的空间位置非常有价值，并且可以清楚地显示不同细胞器的物理和空间特征。亚细胞标记物可以帮助您研究特定细胞器的专有功能、通过细胞器状态评估药物效应，或检测基因敲除模型中的细胞变化。

在设计实验时，您可能需要同时选择目的蛋白的特异性检测试剂及一个或多个亚细胞定位试剂。然而，并非所有试剂都普遍兼容。取决于模式物种和染色实验步骤，试剂的表现可能有差异。本指南将帮助您找到最适合您实验的亚细胞标记物。 

常见亚细胞标记物的推荐抗体和实验步骤

在本博客中，我们重点关注了五个主要的亚细胞定位：细胞骨架、线粒体、内质网 (ER)、高尔基体和核包膜。

需要说明的是，本文略过了某些细胞定位，原因包括：需要特定标记物（如早期内体需要 Rab5、中心粒需要 PCM1 等特殊标记物）；存在更高效的标记方法（如细胞核可通过 DAPI、DRAQ5 和碘化丙啶等荧光染料快速标记）。

使用 PCM-1 (G2000) Antibody #5213（绿色）对 A204 细胞进行免疫荧光分析。肌动蛋白丝由 DyLight 554 phalloidin #13054（红色）标记。荧光 DNA 染料 = DRAQ5® #4084。

使用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961、Neurogranin #79519（绿色）、GFAP #3656（青色）和 S6 Ribosomal Protein #5548（红色）对小鼠视网膜组织进行免疫荧光分析。

我们评估的试剂在人、小鼠和大鼠细胞中进行测试，采用了 Cell Signaling Technology 推荐用于免疫荧光实验的三种主要方案：

• 甲醛固定结合 Triton™ X-100 通透处理
• 甲醛固定结合甲醇通透处理
• 甲醇固定

本着为指定实验步骤或物种确定最佳标志物的目标，我们已使用以下两个标准在指定定位内比较多种抗体，评估实验步骤和物种性能：特异性和信号强度。跨物种和实验步骤的性能已针对定位内部每个类别标的性能最佳者归一化，并依据 0至100 的量表评估。这使我们能够在雷达图中比较多个变量。

为避免在具体实验步骤或物种中推荐产生非特异性模式的产品（例如，用线粒体标志物进行核仁标记），如果观察到非特异性模式，将该产品相对于该类别给予 0。 

出于这项实验的目的，在 96 孔板的单孔中对按推荐稀释度于 100 μL 抗体稀释剂中稀释的每种抗体做一式三份测试。一抗在 4°C 下孵育过夜。使用 1:500 稀释的宿主适用性 Alexa Fluor^® 488 conjugated secondary (Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412 或 Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408) 抗体标记一抗。在室温避光孵育二抗一小时。通过高内涵分析法分析96 孔板，包括生成 MFI 数据的激光扫描图像细胞仪和生成 200 倍DAPI 图像与 488 信道图像的自动成像仪。  

您还可以在此处找到完整的细胞器标记物抗体列表。 

CST 推荐的常见亚细胞标记物抗体和实验步骤

使用雷达图遍历每次亚细胞定位比较产品性能，这允许我们确定每个类别的最佳表现。本博客末尾提供了所有雷达图表，而下面提供了每个定位的最佳表现者的详细信息。 

细胞骨架标记物：鬼笔环肽和 α-微管蛋白

使用细胞骨架标记物时，通过使用鬼笔环肽接合物（一种与纤丝状肌动蛋白紧密结合的鬼笔毒素）获得了最大的实验灵活性。因为这是一种非抗体标记方法，故而允许您为其他标志物保留宿主物种。鬼笔环肽有一个使用缺点 — 它不相容于甲醇透化或固定。  

如果实验中需用甲醇，则 α-Tubulin (DM1A) Mouse mAb #3873 在甲醇处理的样品中提供稳健信号。

谨记，与肌动蛋白（微丝）相比，微管蛋白标示细胞骨架的不同成分（微管）。取决于细胞类型，细胞骨架的第三种组分——中间丝——具有不同的蛋白质，因此不能纳入这个实验。 

高尔基体标记物：GM130 和 RCAS1 

我们发现高尔基体标记物y有利于甲醛固定加 Triton™ X-100 透化。但是，如果您处理人样品，GM130 (D6B1) XP^® Rabbit mAb #12480 具有很大的实验步骤灵活性。 

RCAS1 (D2B6N) XP^® Rabbit mAb #12290 只要包括甲醛固定，就可以在多种物种中发挥作用。 

内质网 (ER) 标记物：PDI 或钙网蛋白

我们通常建议在处理 ER 特异性蛋白质时测试甲醛固定或甲醛固定加甲醇透化。但是，在这个实验中，PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501 配合所有受测实验步骤和物种均表现良好。 

Calreticulin (D3E6) XP^® Rabbit mAb #12238 与单独的甲醛固定不兼容，需要甲醇透化或甲醇固定。 

线粒体标记物：AIF、COX IV 和 SDHA

有许多可用的线粒体标记物。在 Cell Signaling Technology 内部，首选的线粒体标记物是 AIF (D39D2) XP^® Rabbit mAb #5318，因为它与许多物种和实验步骤相容。AIF Antibody #4642 在信号方面略胜于 #5318；但是，我们在内部首选 XP^® 单克隆抗体。 

在需要甲醇固定且物种为人类或大鼠的情况下，COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850 可能比 AIF 抗体表现更好。 

在处理小鼠细胞时，SDHA (D6J9M) XP^® Rabbit mAb #11998 在甲醇透化的样品中表现略好于 AIF 抗体。 

核包膜标记物：Lamin A/C

对于核包膜标志物，有一个明确的赢家。Lamin A/C (4C11) Mouse mAb #4777 在所有物种和大多数实验步骤中均有效，并提供清晰明显的信号，后者随甲醇固定略减弱。

免疫荧光实验前的注意点 

前文我们已针对每个亚细胞定位，根据实验方案需求讨论了最佳 CST 抗体。

如同往常，实验成功的最重要因素是小心处理样品。在固定之前考虑细胞的健康状况和汇合度，因为这些因素会影响您的实验。确保您的样品充分固定，并避免让样品变干，因为这会对免疫荧光实验产生负面影响。 

雷达图