如果您已执行 CUT&RUN、CUT&Tag 或 ChIP/ChIP-seq 实验，您知道使用高质量抗体来生成您可以信任的数据是多么重要。但是，您是否知道 CST 还提供染色质分析测定支持试剂，以确保数据质量和可重复性？
本博客讨论非抗体支持试剂如何影响您的数据，并回答您在优化染色质分析实验时可能遇到的以下问题：
- 我应该在 ChIP/ChIP-seq 实验中使用哪些磁珠？
- 对 ChIP/ChIP-seq 染色质进行超声处理时，如何保护染色质和抗体表位？
- 在使用 MNase 进行 ChIP/ChIP-seq 染色质片段化时，如何最大程度地减少变异性？
- 我可以在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验中使用 DNA 纯化柱吗？
- 我应该在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验中使用什么浓度的洋地黄皂苷？
- 我应该在 CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验中使用多少 pAG-MNase 和 pAG-Tn5？
CST 在这里支持您的所有染色质分析需求——在这些辅助试剂到达您的工作台之前开发、配制并进行严格验证，从而确保您的数据质量。奖励？这些试剂可作为现成的 CUT&RUN、CUT&Tag 或 ChIP/ChIP-seq 试剂盒提供或以单件形式提供，以方便您使用。
毕竟，只是因为缓冲液或酶没有按照应有的方式发挥作用而导致实验失败或产生模棱两可的结果，谁会愿意为此花费那么多时间进行实验？
我应该在 ChIP/ChIP-seq 实验中使用哪些磁珠？
蛋白 G 琼脂糖或磁珠与抗体结合使用，以富集染色质结合的目的蛋白。然而，有许多类型的磁珠可用。您如何知道哪些磁珠能够提供最佳的染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 ChIP-seq 数据？CST 开发了 ChIP 级磁珠，让您更轻松地选择磁珠。
CST 科学家评估了不同类型的磁珠，以确定提供最佳富集和最小背景的磁珠。在开发 ChIP 级磁珠时，还评估了不同的偶联化学。为了产生更好的信噪比，ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006 在含 BSA 的缓冲液中配制，以阻断非特异性蛋白结合，而 ChIP-Grade Protein G Agarose Beads #9007 在含有 BSA（以阻断非特异性蛋白结合）和经超声处理的鲑鱼精子 DNA（以阻断非特异性 DNA 结合）的缓冲液中保存。
请注意，如果您正在进行 ChIP-seq，则需要使用 ChIP 级磁珠，因为与琼脂糖珠结合的鲑鱼精子 DNA 可能会污染您的测序结果。
与 IP 级磁珠相比，ChIP 级磁珠可产生更好的信噪比
图 1. 利用 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006 或 IP-Grade Protein A Magnetic Beads，使用来自 HeLa 细胞的已消化染色质和所示抗体进行 ChIP。使用针对所示基因的引物，通过实时定量 qPCR 分析纯化的 DNA。纯化 DNA 的表达为占染色质总输入量的百分比。
对 ChIP/ChIP-seq 染色质进行超声处理时，如何保护染色质和抗体表位？
超声处理是一种用于片段化染色质的方法，使其可溶且易于共沉淀。然而，超声处理可能会出现严重的碎裂，从而可能导致染色质和抗体结合表位受损。CST 的细胞和核裂解缓冲液经过配制，可以更好地保护染色质和抗体表位的完整性，但仍然可以有效地裂解染色质并使抗体易于结合以进行免疫沉淀 (IP)。这在研究转录因子和辅助因子时尤其重要，因为它们与染色质的结合比组蛋白标记更弱，而且通常含量较低。
与竞争对手相比，SimpleChIP® Sonication Cell and Nuclear Lysis Buffers #81804 也作为 SimpleChIP Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 的一部分提供，可为组蛋白标记提供等效的下一代测序（NGS）结果。然而，转录因子和辅因子的 NGS 信噪比表明，与竞争对手产品相比，CST 缓冲液有助于提供更出色的结果。
在分析转录因子或辅因子相互作用时，CST 超声处理和胞核裂解缓冲液的性能优于竞争对手产品
图 2. 根据试剂盒制造商提供的方案，使用来自 4 x 106 HCT 116 细胞的交联染色质制备染色质，并使用指定抗体进行免疫富集。左边的 ChIP-seq 轨迹表明局部目的区域出现目的蛋白富集。右边的综合基因分析得出了在全基因组中发现的所有确定波峰的信噪比。输入样本用作 ChIP-seq 轨迹视图和综合基因分析的阴性对照。
在使用 MNase 进行 ChIP/ChIP-seq 染色质片段化时，如何最大程度地减少变异性？
染色质片段化的另一种选择是使用微球菌核酸酶 (MNase) 而不是超声处理。使用 MNase 时需要考虑的是，即使使用相同的浓度，不同批次的酶活性也会有所不同。为了帮助您避免这种测定间不一致的根源并节省您的时间，CST 在验证过程中对 Micrococcal Nuclease #10011 的酶活性（而不是浓度）进行标准化。对每个新批次的 MNase 进行滴定实验，以与之前批次进行平行比较来评估活性，因此当您将 0.5 µL 来自 CST 的 MNase 添加到 400 万个细胞中时，您始终会得到相同的染色质消化模式。
在下面的示例中，新批次的 MNase 经配制后表现出与旧批次相同的活性，两者均产生所需的染色质消化模式。
通过酶活性使 MNase 标准化可确保批间一致性
图 3. 每次消化对 400 万个 HDLM-2 细胞进行甲醛交联，并按照 SimpleChIP® Plus 染色质免疫沉淀实验步骤（磁珠）中的描述，通过逐渐增加两个不同批次的 Micrococcal Nuclease #10011 用量来制备和消化染色质。如图所示，在 1% 琼脂糖凝胶上分离消化的染色质 DNA 样品。所需的染色质消化带模式如泳道 4 和泳道 9 中所显示。
我可以在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验中使用 DNA 纯化柱吗？
CUT&RUN 和 CUT&Tag 是替代 ChIP-seq 的一种更快且更具成本效益的方法。开发了 CUT&RUN 和 CUT&Tag 检测方法的 Henikoff 实验室最初建议使用苯酚-氯仿提取来纯化 DNA，因为 CUT&RUN 生成的 DNA 片段比 ChIP 生成的片段小。遗憾的是，苯酚-氯仿是一种非常混乱且耗时的方法。色谱柱更易于使用，但并非所有 DNA 纯化柱都是一样的。CST 的科学家已经验证，我们的纯化柱可以有效纯化 CUT&RUN 和 CUT&Tag 测定中生成的较小 DNA 片段。
DNA Purification Buffer and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209 可回收 ≥ 35 bps 的 DNA 片段，确保回收超过 98% 的 CUT&RUN DNA 片段，因为这些片段中只有不到 2% 小于 35 bps。该色谱柱还与 CUT&Tag 兼容，因为标记的片段至少为 70 bps，因为接头蛋白在纯化前已连接到目的 DNA。每个新批次色谱柱的 DNA 片段回收率均通过真正的染色质分析测试来确认，从而保证为您的首选应用提供一致的性能。
CUT&RUN 片段 DNA 纯化方法比较。
图 4.(A) 将低量程 DNA 标准品混合物（泳道 1，未纯化）使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209（泳道 2）或苯酚/氯仿提取后接乙醇沉淀法（泳道 3）纯化，并通过在 4% 琼脂糖凝胶上电泳来分离。如图所示，苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段，而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用 Bioanalyzer 系统分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此，文库制备后，起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp（图中用蓝色垂直线标注）。如所示，CUT&RUN 富集的总 DNA 片段中有不到 2% 短于 175 bp（起始长度 35 bp），这提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。
我应该在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验中使用什么浓度的洋地黄皂苷？
进行 CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验时使用的洋地黄苷需要使细胞和核膜透化，使酶和抗体能够进入，但又不能使包括 DNA 在内的所有物质都出来，因为这会增加测定背景。与 MNase 一样，即使使用相同浓度的洋地黄苷，洋地黄苷的活性也会因批次而异。因此，应进行滴定实验来评估活性。
CST 会对每个新批次的洋地黄皂苷溶液 #16359 进行滴定，以确保批次之间的活性水平相同，从而为您节省时间。每个新批次都与之前批次进行平行测试，并根据信号强度而不是浓度进行标准化。然后使用 NGS 对照旧批次，测试新批次的最佳浓度，以确认获得同等性能。
洋地黄皂苷滴定确保批次之间的活性一致
图 5. 使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，以 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit #9751 进行 CUT&RUN。（A）按照指示，在缓冲液中使用不同批次且不同浓度的 洋地黄皂苷溶液 #16359。使用人 GAPDH 外显子 1 引物、SimpleChIP ® Human β-Actin Promoter Primers #13653 和 SimpleChIP ® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490，通过实时 PCR 对富集的 DNA 定量。每个样品中富集 DNA 的量表示为相对于输入 DNA 总量的信号。（B）在缓冲液中使用新批次洋地黄皂苷溶液 #16359 的 1.5% 的最佳浓度，并使用 NGS 与旧批次进行平行比较。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示结合作用遍及 GAPDH，GAPDH 是 H3K4me3 的已知靶标基因。
我应该在 CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验中使用多少 pAG-MNase 和 pAG-Tn5？
CST 已分别针对 CUT&RUN 和 CUT&Tag 开发并配制了 pAG-MNase 和 pAG-Tn5 酶，以实现最佳性能和批次间可重现性。每个新批次都经过酶活性而非浓度验证，以确保结果一致。
用于执行 CUT&RUN 实验的 pAG-MNase 酶在用量方面具有耐受性。然而，在配制和验证 CUT&RUN Assay Kit #86652 以及 CUT&RUN pAG-MNase and Spike-In DNA #40366 附带的 pAG-MNase 时，CST 仍会针对之前的批次进行平行滴定和 NGS 测试。
通过酶活性使 pAG-MNase 标准化可确保批间一致性
图 6. 使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，以 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit #9751 进行 CUT&RUN。（A）按照指示，在缓冲液中使用不同批次且不同浓度的 pAG-MNase #40366。使用人 GAPDH 外显子 1 引物、SimpleChIP ® Human β-Actin Promoter Primers #13653 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490，通过实时 PCR 对富集的 DNA 定量。每个样品中富集 DNA 的量表示为相对于输入 DNA 总量的信号。（B）测定中使用的新批次 pAG-MNase #40366 的最佳体积为 1.5 μl，并使用 NGS 与旧批次进行平行比较。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示结合作用遍及 GAPDH，GAPDH 是 H3K4me3 的已知靶标基因。
成功的 CUT&Tag 测定更依赖于 pAG-Tn5 酶的活性而不是使用的数量，因为在我们的内部测试中，每个反应中使用超过推荐量的酶时，并未观察到读段数目、峰数目或信噪比出现增加（请参阅 CUT&Tag 常见问题解答页面中的更多详细信息）。为了确保批次间性能一致，pAG-Tn5 (Loaded) #79561 酶（还附带 CUT&Tag Assay Kit #77552）通过 NGS 进行验证，方法是将新批次与之前批次进行平行滴定。pAG-Tn5 酶的活性会随着时间的推移而减弱，因此必须将酶储存在 -20°C 下，并在小瓶上列出的有效期之前使用酶。
通过酶活性将 pAG-Tn5 标准化可确保批间一致性
图 7. 使用 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 CUT&Tag。按照所示，在测定中使用不同批次且不同量的 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561。使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示结合作用遍及 GAPDH，GAPDH 是一种已知的 H3K4me3 靶标基因。
博客：CUT&Tag DNA 文库产率：如果使用 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时您的文库产量太低以致于检不出，怎么办
CST：您的一站式染色质分析商店
使用 CST 开发和验证的 ChIP、CUT&RUN 和 CUT&Tag 试剂，不仅可以节省您的时间，而且可以减少麻烦。我们的科学家花费了大量时间优化缓冲液、酶和 DNA 纯化柱，以便您获得最佳结果。我们还为您进行滴定，并将其与之前的批次进行比较，以确保批间一致性，从而保证随着时间推移的可重复性。再加上针对您选择的应用而经过严格验证的抗体，您将在不知不觉中生成您认可的染色质分析数据。
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