4 个步骤更利于免疫组织化学实验：第 2、3 和 4 步

这是有关如何优化 IHC（免疫组织化学）实验步骤的两部分系列中的第二部分。第一部分介绍了抗原修复的原理。如果你错过了，请点击此处查看。但如果您已经制备好了组织并准备开始，我们将继续进行染色实验步骤中的后续步骤。

第 2 步：一抗稀释剂

好的 IHC（免疫组织化学）实验方法可以为特异性识别和结合的提供适宜条件。因此，你必须调整抗体稀释剂的离子强度和 pH 值，以便达到你尝试检测的特定抗原-表位相互作用。TBST（137 mM NaCl、20 mM Tris、0.1% Tween-20；pH 7.6）通常用于这个目的。它与生理盐水为等渗压，且在生理 pH 值 为 7.2-7.6 左右时有缓冲作用。这些条件模拟了一个免疫系统相互作用的自然进程中抗体和抗原结合的环境。结果是，TBST 能很好地作用于许多抗体，但并非全部。例如，使用 TBST 稀释时，PLK1 (208G4) Rabbit mAb 会产生有限的信号，但使用 SignalStain^® Antibody Diluent (CST (Cell Signaling Technology) #8112)(B) 稀释时，信号增强。

其他一些获专利的稀释剂可在市场上买到，并且每种稀释剂由含有缓冲组分、去垢剂和/或蛋白稳定剂的不同混合物组成。在这种情况，相比 TBST，获专利的抗体稀释混合剂支持 PLK1 (208G4) 与其表位之间的相互作用。每种市场上能买到的稀释混合剂都获得了专利，因此研究人员需要逐一确定每种混合剂的适用性。

接下来是……

第 3 步：检测试剂

检测试剂会通过二抗中间物直接或间接结合一抗，从而将酶（通常是辣根过氧化物酶 (HRP)）运送到特定表位位点。加入 HRP 显色底物时，形成的沉淀物会沉积在一抗/抗原结合事件发生的位点，这通过显微镜检查便可观察到。

通常，生物素和链霉亲和素会促进这种相互作用：二抗偶联可结合链霉亲和素的生物素，而链霉亲和素分子本身就能偶联 HRP。这种方法有一些限制。首先，链霉亲和素-HRP 复合体能结合内源性生物素，并产生明显的背景信号。如果使用 HIER（见第 1 步），内源性生物素的问题就更加严重了，因为隐藏的生物素会沿着其他表位显示。  其次，显色信号的强度取决于存在的酶的数量（即酶越多，信号越强），但结合一抗/抗原相互作用位点的 HRP 分子的数量则受限于结合复合体的链霉亲和素分子的数量。

聚合物系统很受欢迎，因为它们能避免生物素系统的限制。在这种方法中，葡聚糖等聚合物能同时偶联二抗和 HRP 酶。聚合物主链可以无需在一抗/抗原位点形成生物素-链霉亲和素-HRP 复合体，从而避免可能的生物素背景噪音。另外，相对于链霉亲和素系统，可以结合的 HRP 分子的数量更多，因此更少的一抗/抗原结合位点可以相应产生更多的信号，从而增加了检测的敏感性。

当我们使用生物素检测系统来评估 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体时，我们发现它无法产生足够强的信号，即使我们已经更换了其他配套试剂也是如此。因此，我们转而使用更加敏感的聚合物检测方法。  尽管信号 (C) 明显增强，但不足以满足我们的标准。

但我们还有更多方法……

第 4 步：色原

DAB（3,3'-二氨基联苯胺）、AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）或 Vector^® NovaRED™ 等色原是会与结合检测试剂的 HRP 发生相互作用的底物。有几种显色底物可以使用，它们能产生各种颜色，颜色强度也不同。在设计你的实验时，选择的色原所产生的颜色要能与你的复染色形成适当对比度，而且其强度足以显示你尝试检测的抗原。

最初，我们使用 Vector^® NovaRED™ (Vector Laboratories) 作为色原来测试 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体，这种色原能产生一种亮红色的沉淀物。但 NovaRED 不能产生足够强的信号，因此我们转而使用强度更高的深褐色 DAB。使用 DAB 底物联合特定稀释剂和检测系统​产生的信号足够强 (D)，因此，我们最终才建议根据含特定配套试剂的明确实验步骤，在 IHC（免疫组织化学）使用 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体。

类似的实验步骤优化应该可以帮助你充分利用自己的 IHC（免疫组织化学）研究。如需更多有用提示，请下载 CST (Cell Signaling Technology) 指南以成功进行免疫组织化学实验：