细胞死亡机制：凋亡

什么是凋亡？

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡 (PCD)，其特征包括细胞皱缩、染色质凝聚、膜起泡和核碎裂。它对于形成和维持健康组织至关重要，几乎所有生物体在早期胚胎发育过程中都依靠细胞凋亡来清除多余细胞。它也是维持组织稳态的关键环节，通过清除衰老或受损细胞来平衡细胞群体的增殖与死亡。

然而当细胞凋亡过程紊乱时，后果可能十分严重。过度凋亡会导致发育异常和神经退行性疾病，而凋亡不足则可能使受损或不需要的细胞存活，从而促进癌症进展、自身免疫疾病和慢性病毒感染。 

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本博客将探讨细胞凋亡的分子机制、信号通路及相关蛋白，并介绍研究其在健康与疾病中作用的关键检测方法与标记物。

凋亡机制：内在和外在通路

细胞凋亡是一个受到精密调控的过程，其特征包括独特的形态学改变、特定胱天蛋白酶 (caspase) 的激活以及线粒体控制通路的启动。 

有两种主要机制可以触发凋亡：

线粒体内在通路由细胞应激、DNA 损伤、发育信号或缺乏生存因子激活。 » 探索细胞凋亡的线粒体控制通路

外源性细胞死亡受体通路由外部死亡信号触发，例如死亡配体（FasL、TNF-α 等）与细胞表面受体的结合。  » 探索死亡受体信号转导通路

内在和外在通路都会激活复杂的信号级联反应，推动细胞经历早期、中期和晚期凋亡。各阶段发生的关键事件如下：

• 早期阶段：外在通路的早期细胞凋亡表现为死亡配体结合并形成 DISC 复合体，内在通路则表现为通过细胞应激激活促凋亡 Bcl-2 家族蛋白。这会导致线粒体外膜通透性 (MOMP)、促凋亡蛋白（如 Bax 和 Bak）的激活和向线粒体转位、细胞色素 c 释放，以及起始型 caspase（外在通路为 caspase-8，内在通路为 caspase-9）的激活。与此同时，磷脂酰丝氨酸转位到质膜外侧。
• 中期阶段： 执行 caspase（caspase-3、caspase-6 和 caspase-7）被激活，导致剪切 PARP 和核纤层蛋白 A/C 等关键底物，引发细胞皱缩、细胞骨架解体、染色质凝聚和核碎裂。
• 晚期阶段： DNA 片段化、膜泡形成和凋亡小体产生，随后被吞噬细胞识别和清除。

由于细胞凋亡与自噬、坏死等其他程序性死亡方式存在部分重叠特征和通路，通常需要联合多种标记物和检测方法来确定细胞死亡发生的类型与阶段。后续章节将更详细地阐述细胞凋亡的机制，以帮助您确定在实验模型中识别细胞凋亡的最合适方法。

检测细胞凋亡：关键标记物与分析方法

TUNEL 测定法

在细胞凋亡的晚期，DNA 被核酸内切酶片段化，将染色质切割成核小体单位，这些单位可以在凝胶上显示为 DNA 梯状。DNA 片段化同时也是 TUNEL 测定法的基础原理，这项原位凋亡监测技术作为细胞死亡鉴定的可靠手段，已在科研领域获得广泛应用。TUNEL 检测法采用荧光标记的修饰 dUTP 对断裂 DNA 的 3' 羟基末端进行标记，该标记信号随后可通过免疫荧光 (IF)、免疫组织化学 (IHC) 或流式细胞术进行检测。 

图 1 显示了小鼠发育胚胎中的 DNA 片段化现象（红色），其中趾间细胞通过程序性死亡实现指节分离，这是细胞凋亡的经典范例。

图 1. 低倍镜（左）与高倍镜（右）下冷冻固定小鼠胚胎 (E14.5) 趾节分离过程中经历凋亡的细胞。TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 594 nm) #48513 测定（红色）揭示了凋亡的 DNA 片段化特征，而重组单克隆抗体 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664（绿色）识别执行内在凋亡通路的细胞。DAPI #4083（蓝色）染色标记所有细胞核，展示细胞组织结构。

但需注意，由于 DNA 片段化也可能发生在坏死过程中，因此绝不能仅凭 TUNEL 结果区分凋亡与其他细胞死亡形式。此时，形态学分析可辅助判断：凋亡的 DNA 损伤伴随小而圆、均匀分布的凋亡小体，而坏死的 DNA 断裂则呈现无序状态并伴随细胞裂解。

CST TUNEL 检测试剂盒简单、易于使用，可当天获得培养细胞、组织及石蜡包埋样本的检测结果： • TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 594 nm) #48513 • TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 640 nm) #64936 • TUNEL Assay Kit (Fluorescence, 488 nm) #25879

表征细胞膜变化

另一种检测细胞凋亡的方法是观察细胞膜的变化。值得注意的是，在凋亡早期和中期，细胞膜始终保持完整，从而避免对周围组织造成损伤和炎症反应。这使得细胞因子和消化酶不会释放到细胞外空间——这一特征有助于将凋亡与其他形式的细胞死亡区分开来。

细胞凋亡的一个标志性特征是：通常朝向细胞质的细胞膜内磷脂酰丝氨酸脂质会外翻至细胞表面，暴露于细胞外空间。它们的存在就像一个“吃掉我”的信号，促使吞噬细胞清除死细胞。由于膜联蛋白 V (Annexin V) 能够与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸脂质结合，因此常被用作早期细胞凋亡的标记物。但需注意，磷脂酰丝氨酸在坏死细胞裂解时或凋亡晚期膜通透性改变时也会外露，因此务必如图 2 所示，将膜联蛋白 V 染色与碘化丙啶 (PI) 等活性染料联合使用。PI 是一种荧光 DNA 染料，仅在细胞膜受损时（坏死或凋亡晚期）才能进行染色。

图 2. 使用 Annexin V-FITC Early Apoptosis Detection Kit #6592（绿色）对经凋亡诱导剂 camptothecin 处理的活性 Jurkat 细胞进行荧光免疫荧光分析，绿色标记显示磷脂酰丝氨酸外翻的细胞（早期凋亡标志）。碘化丙啶（红色）显示细胞膜具有通透性，这种情况发生在细胞坏死或晚期凋亡过程中。DRAQ5^® #4084（蓝色）标记所有细胞核 DNA。

用于检测早期凋亡的 CST 试剂盒及产品：  • Annexin V-FITC Early Apoptosis Detection Kit #6592 • Annexin V-PE Early Apoptosis Detection Kit #40295 • Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087 • Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) #13296

细胞凋亡中的 Bcl-2 蛋白家族

线粒体内在凋亡通路涉及多种保守信号转导蛋白，并依赖于线粒体完整性。Bcl-2 家族中蛋白质活性之间的平衡严格控制着这一过程，Bcl-2 家族蛋白由促凋亡因子（Bax、Bak、Bad、Bid、Puma、Bim 和 Noxa）和抗凋亡因子（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1/Bfl-1 和 Mcl-1）构成。

促细胞凋亡的 Bcl-2 家族成员分为两类：多结构域执行者，例如 Bax 和 Bak，含有多个 Bcl-2 同源性 (BH) 结构域（BH1、BH2 和 BH3），以及仅含有 BH3 结构域的蛋白质，包括 Bad、Bid、Puma、Bim 和 Noxa。（注意：Bid 也可以在外部通路中被激活以放大凋亡信号。）

这两类蛋白与抗凋亡蛋白的相互作用通过 BH 结构域介导——仅含 BH3 结构域的蛋白可结合抗凋亡 Bcl-2 家族成员，中和其功能并激活 Bax/Bak，从而导致线粒体外膜通透化和细胞凋亡。

这种相互作用是癌症治疗中利用 BH3 模拟物（即模拟仅含 BH3 结构域蛋白功能的小分子）进行治疗的靶点。例如 Bcl-2 抑制剂 Venetoclax，可通过结合抗凋亡 Bcl-2 蛋白释放促凋亡蛋白，促进癌细胞死亡。

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在细胞应激期间或翻译后修饰作用下，仅含 BH3 结构域的蛋白被激活并转位至线粒体，与多结构域执行蛋白 Bax 和 Bak相互作用并将其激活。图 3 中的 Bim 和 Bak 等促凋亡蛋白在线粒体的共定位是细胞凋亡启动的标志，因为它标志着细胞走向自我毁灭的关键步骤。

图 3. 上图：使用重组单克隆抗体 Bim (C34C5) Rabbit mAb #2933（绿色）进行免疫荧光分析，显示 BIM 与线粒体的共定位。下图：使用重组单克隆抗体 Bak (D4E4) Rabbit mAb #12105（绿色）进行免疫荧光分析，显示 BAK 与线粒体的共定位。两图中，线粒体均已用 MitoTracker Red CMXRos #9082（红色）标记，DRAQ5^® #4084（蓝色）标记所有细胞核 DNA。

Bax 和 Bak 被激活后，会诱导线粒体外膜通透性 (MOMP) 的变化，从而导致细胞色素 c 的释放，这是线粒体内在凋亡通路的标志。然后，细胞浆中游离的细胞色素 c 与 Apaf-1 形成称为凋亡小体的复合物，进而激活 caspase-9 并引发一系列凋亡事件，最终导致细胞解体。

另一种识别凋亡的方法是测量线粒体膜电位变化以确定 MOMP 发生。此类检测使用 TMRE（四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐）等可穿透线粒体膜的荧光染料——该染料在健康极化线粒体中富集，当线粒体膜电位丧失（凋亡早期事件）时，TMRE 荧光减弱，提示线粒体功能障碍。CST 的 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (II) #13296 包括 TMRE 以及对照化合物 CCCP，它可以解耦联线粒体的氧化磷酸化并导致线粒体膜去极化。

但要注意的是，线粒体膜电位丧失及相关的 TMRE 染色减弱也可能发生在细胞坏死过程中，因此需要结合其他检测方法加以区分。

Caspase 在细胞凋亡中的作用

内在与外在凋亡通路最终都依赖于胱天蛋白酶 (caspases) 的活性，胱天蛋白酶是一类在程序性细胞死亡中起关键作用的半胱氨酸蛋白酶。Caspase 可根据其功能分为两大类：

• 起始型 caspase，包括 caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10 和 caspase-12，它们在促凋亡信号的刺激下被激活。激活后，起始型 caspase 会裂解并激活下游执行型 caspase。 
• 包括 caspase-3、caspase-6 和 caspase-7 在内的执行型 caspase 负责在凋亡期间通过裂解关键结构和调节蛋白来分解细胞。

除了在凋亡中的作用外，部分 caspase 家族成员（如 caspase-1、caspase-4、caspase-5 和 caspase-11）主要参与炎症反应和细胞焦亡（一种特殊的程序性细胞死亡形式）。

探索 CST 的相关抗体小包装组合： • IAP Family Antibody Sampler Kit #9770 •Death Receptor Antibody Sampler Kit II #29603 •Cleaved Caspase Antibody Sampler Kit #9929 •Procaspase Antibody Sampler Kit #12742

在外在通路中，当细胞外配体与 TNFR 家族中的细胞表面死亡受体（Fas、TNF-R1、TNF-R2、DR3、DR4 和 DR5）及其相关配体（包括 TNF-、FasL、TRAIL和TWEAK）结合时，caspase 被激活。配体结合诱导受体活化，可导致死亡诱导信号复合物 (DISC) 的形成，其募集并裂解起始型 caspase-8 以将其激活。如图 4 所示，检测 caspase-8 存在与否可判断细胞群体是否具有发生凋亡的潜力。

图 4. 使用 Caspase-8 (F5K9P) Rabbit mAb #8873 对石蜡包埋的人体子宫内膜样腺癌组织进行免疫组织化学分析。该抗体对全长和裂解的 caspase-8 均有染色，表明这些细胞中可能发生 caspase-8 依赖性细胞凋亡。

裂解后的 caspase-8 随后裂解并激活执行型 caspase，如 caspase-3 和 caspase-7，它们介导细胞底物的裂解和凋亡的特征性形态学改变。靶向活化形式 caspase 或其底物的裂解特异性抗体是鉴定凋亡细胞死亡的重要工具。如图 5 所示，裂解的 caspase-8 的检测是判断外部通路凋亡细胞死亡的关键标记物。

图 5. 使用 Cleaved Caspase-8 (Asp387) (D5B2) XP^® Rabbit mAb #8592（绿色）对未经处理（左图）或经过 TNF-α 和环己酰亚胺处理的 Raw 264.7 细胞进行免疫荧光分析。该抗体标记了发生 caspase-8 激活的细胞（外在细胞凋亡的标志）。蓝色伪彩 = DRAQ5^® #4084 （荧光 DNA 染料）。

在内在通路中，caspase-9 是主要的起始型 caspase。与依赖死亡受体的外在通路不同，内在通路依赖于上述 Bcl-2 蛋白家族成员的线粒体激活。一旦被激活，caspase-9 就会引发级联反应，裂解并激活执行型 caspase，从而导致细胞解体。

由于在两条通路中均保守存在，图 6 所示的裂解的 PARP、裂解的核纤层蛋白 A/C 以及裂解的 caspase-3 被公认为 caspase 活性和凋亡激活的标记物。

图 6. 对未经处理（左图）或经 Staurosporine #9953 处理（右图）并用重组单克隆抗体 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664（绿色）标记的 HT-29 细胞进行免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor^® 555 phalloidin #8953（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5^® #4084（荧光 DNA 染料）。

IAP 家族蛋白对 Caspase 的抑制

凋亡抑制剂 (IAP) 家族的蛋白质包括 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Livin 和 Survivin，可阻断不同 caspase 的活性以抑制凋亡。 

例如，XIAP 与 caspase-3、caspase-7 和 caspase-9 结合，以抑制其活性并防止关键凋亡蛋白的剪切。IAP 家族成员的表达是细胞存活增强的指标。

IAP 家族与 caspase 通过保守的杆状病毒 IAP 重复序列 (BIR) 结构域相互作用。值得注意的是，部分 IAP 成员（如 c-IAP1、c-IAP2 和 XIAP）还含有具有泛素 E3 连接酶活性的 RING 结构域。通过其 RING 结构域，这些蛋白质可以泛素化并促进几种重要信号蛋白的降解，包括经典 TNF 死亡受体通路中的蛋白，从而调节细胞死亡和炎症反应。

死亡受体通路也可以通过 TNFR2 介导的 NF-κB 信号活化，诱导促存活基因 Bcl-2 和 FLIP 表达，致使细胞存活。

其他资源

要更多了解参与多种类型细胞死亡的机制、形态和关键蛋白质，请下载下面的指南： 

阅读细胞死亡机制系列中的其他博客文章： 

• 细胞死亡机制：铁死亡
• 细胞死亡机制：焦亡
• 细胞死亡机制：坏死和坏死性凋亡

参考文献

• Dickens LS, Powley IR, Hughes MA, MacFarlane M. The 'complexities' of life and death: death receptor signalling platforms. Exp Cell Res. 2012;318(11):1269-1277. doi:10.1016/j.yexcr.2012.04.005
• Favaloro B, Allocati N, Graziano V, Di Ilio C, De Laurenzi V. Role of apoptosis in disease. Aging (Albany NY). 2012;4(5):330-349. doi:10.18632/aging.100459
• Diepstraten ST, Anderson MA, Czabotar PE, Lessene G, Strasser A, Kelly GL. The manipulation of apoptosis for cancer therapy using BH3-mimetic drugs. Nat Rev Cancer. 2022;22(1):45-64. doi:10.1038/s41568-021-00407-4
• McIlwain DR, Berger T, Mak TW. Caspase functions in cell death and disease [published correction appears in Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015 Apr;7(4). pii: a026716. doi: 10.1101/cshperspect.a026716]. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(4):a008656. Published 2013 Apr 1. doi:10.1101/cshperspect.a008656
• Shamas-Din A, Kale J, Leber B, Andrews DW. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(4):a008714. Published 2013 Apr 1. doi:10.1101/cshperspect.a008714

2025 年 4 月更新。最初发布于 2021 年 6 月。 20-CEP-9437 和 25-HMC-18550