流式细胞术对照赋予 CAR 研究信心的三大理由

嵌合抗原受体 (CAR) 细胞疗法不断取得进展，但开发和表征 CAR 工程细胞所需的高成本与长周期仍是瓶颈。

CST^® CAR 接头重组单克隆抗体靶向基于 scFv 的 CAR 中广泛使用的 G4S 或 Whitlow/218 肽接头序列，而非可变重链、可变轻链结构域或铰链区。由此，这些抗体通过提供一种通用的、基于流式细胞术的方法来检测和确认 CAR 的存在（无论其抗原特异性如何），从而简化了 CAR 表征工作流程。为进一步简化 CAR 检测并提高可重复性，CST 开发了 Posibeads™ 对照珠子——这是用于抗 CAR 接头检测的即用型、稳定且经济实惠的阳性对照，旨在提升 CAR 检测结果的可信度。

探索用于工程化 CAR 的 CST Posibeads 对照珠子： •Posibeads G4S Linker Positive Control Beads #88651 •Posibeads Whitlow/218 Linker Positive Control Beads #26254

Posibeads 对照珠子：确认您的 CAR 检测实验有效运行

阳性对照有助于确认您的 CAR 检测实验按预期进行。您可以使用已知的 CAR+ 细胞系作为阳性对照，但维持细胞培养既耗时又昂贵。此外，您还需考虑 CAR 表达可能随时间变化。

Posibeads 对照珠子是 CAR 检测实验的独特阳性对照——它们易于使用、表现如悬浮细胞，且不受 CAR 组成或表达影响，性能稳定。这些 5nm 非荧光聚苯乙烯珠子包被了 G4S 接头肽或 Whitlow/218 接头肽，分别用作 G4S 接头抗体或 Whitlow/218 接头抗体的阳性对照。该珠子可作为独立样本使用，也可混合到实验样本中，与细胞经历相同的免疫染色和洗涤流程。Posibeads 对照珠子经抗 CAR 接头抗体标记，可作为抗体结合功能与荧光染料性能的双重阳性对照。这使您能确信目标细胞无信号是由于缺乏 CAR 表达，而非检测试剂问题。

当 Posibeads 对照珠子直接加入目标样本中时，抗 CAR 接头抗体将同时结合 CAR+ 细胞和 Posibeads 对照珠子，使 CAR 细胞被荧光标记，同时相较于未标记珠子，肽偶联珠子的荧光信号增强。通过前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 数据，可根据大小差异区分并圈选细胞与珠子群体。

将 Posibeads G4S Linker Positive Control Beads #88651 添加到含有野生型 Jurkat 细胞和经过基因工程改造以表达含有 G4S 接头的 scFv 型抗 CD19 CAR 的 Jurkat 细胞的混合活细胞群中。然后用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #2985 或 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #69782 对细胞和 Posibeads 对照珠子进行免疫染色。如图所示（左图），通过前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 区分细胞（蓝色）与 Posibeads 对照珠子（绿色），并展示两种免疫染色条件下细胞（蓝色）和珠子（绿色）的荧光数据 (FL6)。CAR 细胞系由匹兹堡大学 Lohmueller 实验室提供。

Posibeads 试剂经过标准化生产与验证，因此无需再担心因阳性对照的变量导致数据解读偏差。  

详细了解针对 Whitlow/218 和 G4S 的抗 CAR 接头抗体

以下是 Posibeads 对照珠子能增强您的 CAR 检测流式细胞术实验的三大理由：

#1 可靠、经济有效的阳性对照

使用 CAR+ 细胞系作为流式细胞术实验的阳性对照并非理想选择，因为维持培养既耗时又昂贵，且 CAR 表达会随时间变化。Posibeads 试剂是接头抗体偶联物简单经济的阳性对照，让您确信检测试剂如预期正常工作。Posibeads 对照珠子可轻松整合到流式细胞术工作流程中，并能保持信号长期稳定。您只需在样本或独立对照管中加入几微升均匀悬浮的珠子，然后按常规进行免疫染色流程即可。

如果您当前在 CAR 检测流式细胞术实验中未使用任何阳性对照，添加它们非常简单且不会使工作流程复杂化——特别是相较于因不确定阴性信号是源于染色不佳还是样本中确实不存在 CAR+ 细胞，而不得不重复实验所耗费的时间与风险。

#2 实现实验间 CAR 表达标准化

开发 CAR 时，您可能需要探索不同 CAR 结构以优化细胞表面表达，从而微调细胞对目标物的反应。但由于流式细胞仪设置、仪器、操作人员或测试地点差异导致的实验间变异性，结果比较可能具有挑战性。Posibeads 对照珠子可用于标准化每次实验中 CAR+ 细胞的荧光信号，实现多个实验间的数据精准比对。

#3 即使结果空白也能确保数据解读可信度

若无阳性对照，将很难判断流式细胞术数据中荧光信号的缺失是由于免疫染色技术问题，还是样本中确实不存在循环 CAR-T 细胞或正确表达的 CAR。通过将 Posibeads 对照珠子混合到样本中，您可以区分这两种情况，因为阳性对照信号能确认接头抗体偶联物功能正常。当按推荐用量使用时（20,000 个珠子与细胞样本混合或 100,000 个珠子作为独立样本），它们不会与其他细胞和抗体相互作用，也不会干扰 CAR 接头标记，确保您能轻松区分 CAR+ 细胞。

流式细胞术检测用 Posibeads 对照珠子助您的 CAR 研究顺畅运行

随着 CAR-T 疗法持续发展，新工具将不断涌现以促进和加速其开发与表征。Posibeads 对照珠子是 CST CAR 接头抗体的理想搭档，为免疫染色流程提供可靠的阳性对照。无论信号是否存在，它们都能帮助您自信解读数据，并使不同实验间的荧光信号比对更轻松、准确。

了解有关 CST CAR 接头产品的更多信息，包括可用的偶联物和阳性对照珠子：

其他资源

• 探索 CAR 信号转导网络互动通路。
• 观看 CAR-T 视频系列，了解关于如何对 CAR-T 细胞工程化以及当前研究挑战的更多信息。