我如何选择适用于蛋白质印迹法的上样对照？

想想您上次生成蛋白质印迹法数据的时候。您是否发现了实验样品中信号的预测差异，或者当您看到蛋白质水平没有变化时，您还在想什么出了问题？这里还有一个问题：您是否记得探测一种可靠的上样对照蛋白？

我们中的许多人默认使用经典的细胞骨架蛋白或管家蛋白，从未考虑过上样对照蛋白质印迹。然而，这种经常被忽视的蛋白质印迹值得进一步关注的原因有很多。

什么是上样对照？它们为何重要？

上样对照是一种在样品中高度组成性表达的蛋白质，在蛋白质印迹法实验中用作阳性对照。使用上样对照的最重要原因是确保数据和结论的可靠性，因为它有助于证明蛋白质表达的任何差异都是由于实验条件造成的，而不是由于样品上样或膜转移的变化造成的。如果您的样品在凝胶上上样不均匀或膜转移不一致，您将无法知道您的实验是否支持或否认您的假设。

相关电子书：蛋白质印迹法成功指南

典型的上样对照包括针对蛋白质的抗体，例如 GAPDH、β-肌动蛋白、α-微管蛋白、组蛋白 3、黏着斑蛋白和基本细胞功能所需的其他常见管家蛋白。这些蛋白质通常在大多数样品类型中普遍表达，并且它们的丰度通常不受生物变异的影响。然而，根据您的实验条件，不同的抗体可能更合适，因此值得仔细考虑上样对照的选择。

选择上样对照时，需要考虑三个关键标准：

1. 上样对照的蛋白质水平不应因实验条件而改变。 

2. 上样对照和目的蛋白应可易于通过蛋白质印迹法相互区分。

3. 上样对照和目的蛋白检测的信号应在线性范围内。

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那么，在准备对上样对照蛋白进行蛋白质印迹法分析时，您如何解决所有这些原则问题呢？了解如何预防和解决以下一些常见问题。您还可以查找按分子量、亚细胞定位和宿主分类的上样对照蛋白参考表。请务必将此页面添加为书签，以便您在下次需要选择上样对照时可以使用。

1. 上样对照的蛋白质水平不应因实验条件而改变。

选择上样对照的第一步是确保所选择的上样对照蛋白适合正在执行的实验。值得考虑的是靶标蛋白的表达位置，以及是否存在也在同一亚细胞位置表达的上样对照蛋白。例如，如果您已经制备了仅由核蛋白组成的裂解物，则与细胞骨架蛋白相比，它更适用于针对 DNA 结合蛋白进行标准化。

使用 TBP (D5C9H) XP^® Rabbit mAb #44059 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

除了蛋白质的表达位置外，了解该表达如何因您的实验条件而改变也很重要。假设您已经对样品中的总蛋白质进行了量化，并且确信您在凝胶中上样了相同数量的蛋白质。然而，当您查看图像时，您会发现实验样品中的信号与对照样品中的信号明显不同。

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出了什么问题？可能是上样对照蛋白水平受到实验条件的影响。在大多数情况下，在选择上样度对照之前快速进行文献搜索，可以帮助确认所选择的标准化控制蛋白的表达是否会发生任何变化。

2. 上样对照和目的蛋白应可易于通过蛋白质印迹法相互区分。

有时，您正面临最后期限、资源有限（例如，珍贵的样品），或者只是想尽可能地计划最有效的实验。在这些情况下，您可以考虑将上样对照抗体与靶标蛋白抗体共同孵育。现在，在开始混合抗体之前，重要的是要考虑这些结果会是什么样子，以及如何在保持高效的同时保持数据的完整性。

共同孵育抗体时避免复合信号

避免复合信号的一种方法是选择分子量与目的蛋白截然不同的上样对照蛋白。这样做，两种一抗可以共同孵育，并且每个靶标的信号将出现在同一印迹的不同位置。 

下表显示了一些常用作上样对照的蛋白质的分子量和细胞定位：

表 1：常见的上样对照蛋白及其细胞定位和分子量 (kDa)。 

如果您的目的蛋白与您要检测的上样对照蛋白具有相似的分子量，您该怎么办？很简单！只需选择在不同宿主中产生的抗体。通过在支持数据部分下查找来源，可以在每个 CST^® 抗体数据表和网页上找到宿主。

如果在兔子中产生用于检测目的蛋白的抗体，则可以使用在小鼠中产生的上样对照抗体，并将膜与两个一抗共同孵育。洗涤后，您可以用抗兔二级抗体孵育、进行显影，并拍摄显示目的蛋白的条带图像。稍后进行另一个洗涤步骤，印迹可以与抗小鼠二抗一起孵育。像以前一样洗涤、显影和成像，一切就完成了！这一次，您捕获了代表上样对照蛋白的条带。

下表显示了按宿主划分的常见上样对照抗体的 CST 抗体：

表 2：按宿主划分的 CST 常见上样对照抗体。

防止目的蛋白和上样对照蛋白之间信号重叠的最后一个方案是同时采用这两种策略 — 使用上样对照抗体，该抗体可识别分子量与目的蛋白截然不同的蛋白质，并且是在不同的宿主中产生的。这样做可以最大限度地减少混淆哪个条带代表哪种蛋白质的风险。

相关博客：在小鼠组织中的上样对照蛋白表达

在这些策略中，每一种策略都可以节省时间和试剂，而且还让您避免不得不使用珍贵的样品运行重复的凝胶。此外，您肯定会因为在样品间展示一致的凝胶上样以及简化定量分析而获得奖励回报，所有这些工作只需一次印迹法即可完成。只需记住进行多次曝光以捕获两种蛋白质的最佳信号。

3. 上样对照和目的蛋白检测的信号必须在线性范围内。

选择上样对照的最终考虑因素是要考虑信号的线性范围。如果针对上样对照和目的蛋白检测到的信号不在线性范围内，条带将过度曝光或“烧坏”，然后您将无法进行定量分析。 

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进行修复？这种情况下，预防是最好的良药。可能需要对您的实验样品进行滴定，以确定目的蛋白和上样对照的动态范围。提前注意一些事项可以避免为了获得定量数据而不得不回去重复这些印迹实验。对于微型凝胶上的每个泳道，我们建议上样 20–50μg 总蛋白。对于大多数靶标蛋白和模型系统，使用 CST 抗体检测可得到最佳效果。

CST 的 Loading Control Antibody Sampler Kits

CST 有两种 loading control antibody sampler kits，可以帮助您确定实验的理想对照。例如，Loading Control Antibody Sampler Kit (Rabbit) #5142 包含用于以下常见上样对照的抗体：

• β-肌动蛋白：肌动蛋白是一种普遍存在的蛋白，也是真核细胞骨架的主要组分。肌动蛋白主要以 F-肌动蛋白纤维聚合物的形式存在。
• 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)：在糖酵解期间，GAPDH 会催化甘油醛-3-磷酸的磷酸化。近期研究表明，GAPDH 在细胞凋亡、基因表达和核转运过程中均发挥作用。
• 组蛋白 H3：组蛋白（包括组蛋白 H3）构成染色质的主要基本结构－核小体。染色质结构的调整在真核细胞转录调节中起着重要作用。
• β-微管蛋白： 由 α- 和 β-微管蛋白异二聚体组成的球状微管蛋白亚基是微管的基本结构，微管是构成细胞骨架的三类细胞溶质纤维中的一种。
• COX IV： 细胞色素 C 氧化酶 (COX) 是一种异源寡聚酶，由位于线粒体内膜的 13 个亚基组成。它是呼吸链中的末端酶复合物，会催化线粒体内膜中质子的还原反应以促进 ATP 合成。

在小鼠中产生的类似抗体小包装组合 #9774 也可提供。

其他资源： 

• 下载电子书：蛋白质印迹法成功指南。
• 访问我们的蛋白质印迹法 (WB)资源中心，了解 WB 的所有内容。
• 查看我们的蛋白质印迹法疑难排除指南，深入了解有关常见 WB 挑战的信息以及如何识别和修复这些挑战的提示。
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