如何对凋亡蛋白质印迹法、自噬蛋白质印迹法和线粒体自噬蛋白质印迹法设置对照

您是否曾经花时间处理细胞、制备细胞提取物并进行蛋白质印迹法实验，却在看不到预期信号或蛋白质表达变化时感到失望呢？这就不可避免地引出下一个问题——实验是否出了什么问题？免疫印迹法中使用对照细胞提取物作为阳性对照和阴性对照可以告诉您是否存在问题，而若存在问题，则有助确定问题。

处理样品后，您是否看不到蛋白质表达变化，而确实看到信号随对照细胞提取物有变化？那么问题不在于您的抗体，您可能需要仔细检查您的样品制备过程。

如果您正出于以下原因研究细胞死亡相关事件，则对照细胞提取物特别有用：

• 信号诱导：细胞死亡通路极其精妙，这造成有时难以在样品中诱导预期的细胞死亡通路。不同的处理可能导致激活不同的信号级联。
• 样品制备： 知道哪种样品制备方法最佳需要经验和正确的实验步骤。
• 样品采集： 细胞死亡相关靶标常常经历短暂的翻译后修饰 (PTM)，例如剪切事件，因此您可能在错误的时间点制备提取物。

Cell Signaling Technology 提供了几种不同的对照细胞提取物，它们各自由可用于细胞死亡蛋白质印迹实验的阴性对照和阳性对照组成。与含有较高水平已诱导蛋白/目的修饰的阳性对照相比，阴性对照不含或含有较低水平的内源性蛋白质或 PTM。此外，如果您想要实验变量尽量最少化，CST 用来在对照细胞提取物中诱导细胞死亡的大多数化合物（如 依托泊苷、氯喹 和 毒胡萝卜素）也可提供给您处理自己的细胞。

本贴文探讨在研究细胞凋亡、自噬和线粒体自噬时用作蛋白质印迹中阳性对照或阴性对照的最佳对照细胞提取物。

凋亡是一种程序性细胞死亡，它经由作为细胞死亡通路组成部分的胱天冬酶裂解事件介导。其特征在于细胞膜起泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚、DNA 碎裂和 mRNA 衰变。凋亡缺陷牵涉癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。¹ 可以在细胞中使用依托泊苷或细胞色素 c 以化学方式诱导凋亡。^2-3

CST 为通过蛋白质印迹法检测凋亡提供以下两种对照细胞提取物：

• Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043
• Caspase-3 Control Cell Extracts #9663

Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043 和 Caspase-3 Control Cell Extracts #9663 的阳性对照分别从 25 µM 依托泊苷处理 5 小时的总 Jurkat 细胞或细胞色素 c 处理的 Jurkat 细胞的胞质级分产生。两者均可用作凋亡蛋白质印迹法的对照细胞提取物。

图 1.来自 Caspase-3 Control Cell Extracts #9663 新批次测试的代表性数据。显示了 Caspase-9 Antibody #9502（上图）和 Caspase-3 (D3R6Y) Rabbit mAb #14220（下图）的蛋白质印迹分析。如预期，一旦进行细胞色素 c 处理 (+) 就诱导剪切胱天蛋白酶-3 和 -9。在未经处理的提取物中观察到全长形式的两种蛋白质 (-)。批间信号维持不变。

以下是您运行蛋白质印迹法检查凋亡时可以使用 Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2403 和 Caspase-Control Extracts #9663 作为对照的一些靶标。

CHOP Control Cell Extracts #33263 阳性对照是来自 300 nM Thapsigargin 处理 2 小时的 C2C12 细胞的总细胞提取物，并且可在蛋白质印迹实验中用于研究 CHOP 表达和其他线粒体自噬靶标。