如何对凋亡蛋白质印迹法、自噬蛋白质印迹法和线粒体自噬蛋白质印迹法设置对照

您是否曾经花时间处理细胞、制备细胞提取物并进行蛋白质印迹法实验，却在看不到预期信号或蛋白质表达变化时感到失望呢？这就不可避免地引出下一个问题——实验是否出了什么问题？免疫印迹法中使用对照细胞提取物作为阳性对照和阴性对照可以告诉您是否存在问题，而若存在问题，则有助确定问题。

处理样品后，您是否看不到蛋白质表达变化，而确实看到信号随对照细胞提取物有变化？那么问题不在于您的抗体，您可能需要仔细检查您的样品制备过程。

如果您正出于以下原因研究细胞死亡相关事件，则对照细胞提取物特别有用：

• 信号诱导：细胞死亡通路极其精妙，这造成有时难以在样品中诱导预期的细胞死亡通路。不同的处理可能导致激活不同的信号级联。
• 样品制备： 知道哪种样品制备方法最佳需要经验和正确的实验步骤。
• 样品采集： 细胞死亡相关靶标常常经历短暂的翻译后修饰 (PTM)，例如剪切事件，因此您可能在错误的时间点制备提取物。

Cell Signaling Technology 提供了几种不同的对照细胞提取物，它们各自由可用于细胞死亡蛋白质印迹实验的阴性对照和阳性对照组成。与含有较高水平已诱导蛋白/目的修饰的阳性对照相比，阴性对照不含或含有较低水平的内源性蛋白质或 PTM。此外，如果您想要实验变量尽量最少化，CST 用来在对照细胞提取物中诱导细胞死亡的大多数化合物（如 依托泊苷、氯喹 和 毒胡萝卜素）也可提供给您处理自己的细胞。

本贴文探讨在研究细胞凋亡、自噬和线粒体自噬时用作蛋白质印迹中阳性对照或阴性对照的最佳对照细胞提取物。

我应该将哪种对照细胞提取物用于凋亡蛋白质印迹？

凋亡是一种程序性细胞死亡，它经由作为细胞死亡通路组成部分的胱天冬酶裂解事件介导。其特征在于细胞膜起泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚、DNA 碎裂和 mRNA 衰变。凋亡缺陷牵涉癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。¹ 可以在细胞中使用依托泊苷或细胞色素 c 以化学方式诱导凋亡。^2-3

CST 为通过蛋白质印迹法检测凋亡提供以下两种对照细胞提取物：

• Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043
• Caspase-3 Control Cell Extracts #9663

Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043 和 Caspase-3 Control Cell Extracts #9663 的阳性对照分别从 25 µM 依托泊苷处理 5 小时的总 Jurkat 细胞或细胞色素 c 处理的 Jurkat 细胞的胞质级分产生。两者均可用作凋亡蛋白质印迹法的对照细胞提取物。

图 1.来自 Caspase-3 Control Cell Extracts #9663 新批次测试的代表性数据。Caspase-9 Antibody #9502（上图）和 Caspase-3 (D3R6Y) Rabbit mAb #14220（下图）的蛋白质印迹分析。如预期，一旦进行细胞色素 c 处理 (+) 就诱导剪切 caspase-3 和 caspase-9。在未经处理的提取物 (-) 中观察到全长形式的两种蛋白质。批间信号维持不变。 

以下是您运行蛋白质印迹法检查凋亡时可以使用 Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2403 和 Caspase-Control Extracts #9663 作为对照的一些靶标。

我应该将哪些对照细胞提取物用于自噬蛋白质印迹法？

自噬是一种程序性细胞死亡，其中作为自噬信号转导通路的一部分，自噬体和溶酶体移除降解的细胞组分。自噬缺陷已与神经退行性疾病和癌症有关。⁴ 氯喹处理可以诱导自噬。⁵

LC3 Control Cell Extracts #11972 阳性对照是来自 HeLa 细胞的总细胞提取物，这些细胞经 40 µM 氯喹处理过夜，这诱导自噬。以下只是研究自噬时可以对其使用 LC3 Control Cell Extracts #11972 一些部分靶标。

• LC3A/B
• LC3A
• LC3B

图 2.LC3 Control Cell Extracts #11972 新批次测试的代表性数据。显示了 LC3B (E5Q2K) Mouse mAb #83506（左图）、LC3A (D50G8) XP^® Rabbit mAb #4599（中图）和 LC3A/B Antibody #4108（右图）的蛋白质印迹分析。如预期，一旦氯喹处理 (+) 就诱导 LC3 同工型。在未经处理的提取物 (-) 中可以观察到全长形式的 LC3。批间信号在当前批裂解物和新批裂解物之间维持不变。 

我应该将哪些对照细胞提取物用于线粒体自噬蛋白质印迹法？

线粒体自噬是一种专门用于确保线粒体稳态的自噬。当线粒体因损伤或应激而出现缺陷时，发生线粒体自噬。线粒体自噬缺陷已被发现与神经退行性疾病、心血管疾病、代谢疾病和骨骼肌疾病有关。⁶ 毒胡萝卜素处理可以化学诱导线粒体自噬。⁷

CHOP Control Cell Extracts #33263 阳性对照是来自 300 nM Thapsigargin 处理 2 小时的 C2C12 细胞的总细胞提取物，并且可在蛋白质印迹实验中用于研究 CHOP 表达和其他线粒体自噬靶标。  

图 3.CHOP Control Cell Extracts #33263 新批次测试的代表性数据。显示了 CHOP (L63F7) Mouse mAb #2895 的蛋白质印迹分析。如预期，一旦毒胡萝卜素处理 (+) 就诱导 CHOP。在高暴露量时，未经处理的提取物 (-) 中观察到信号非常低。批间信号在当前批裂解物和新批裂解物之间维持不变。

为什么我应该使用 CST 的对照细胞提取物？

CST 科学家进行了完善的初步研究和二次研究，以确定化学诱导细胞死亡的最有效方法。从时程实验到尝试不同的样品制备和收集方法，CST 精心开发和生产对照细胞提取物，以满足您的需求。此外，在验证抗体时，公司内部通常使用产品目录中的相同对照细胞提取物。

CST 对照细胞提取物经过时间检验，因为它们已在公司内部和外部使用多年，并且按照适用于所有 CST 产品的相同严格性接受验证，以确保批间可靠性。这种对产品质量的承诺使数据解释简单明了，因为您知道存在靶标和/或 PTM。

如何验证 CST 对照细胞提取物？首先，检验每批细胞，以确保没有支原体污染。然后进行蛋白质印迹，其中使用多种不同抗体，将新批次对照细胞提取物与先前批次就等同信号强度和背景谱比较。如果预计 PTM 水平有变化，那么 CST 标准要求通过最少使用一种针对靶蛋白总水平的抗体和一种针对靶标的 PTM 的抗体，测试新批次的对照细胞提取物，所有测试都并行实施。

图 4.Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2403 新批次测试的代表性数据。显示了 Caspase-3 (D3R6Y) Rabbit mAb #14220（左上图）、Caspase-7 Antibody #9492（右上图）、PARP Antibody #9542（左下图）和 Cleaved PARP (Asp214) (D64E10) XP^® Rabbit mAb #5625 的蛋白质印迹分析。如预期，在依托泊苷处理 (+) 的提取物和未经处理 (-) 的提取物中都观察到信号。信号在当前批裂解物和新批次裂解物之间维持不变。

设置控制细胞死亡蛋白质印迹对照

对照细胞提取物是一种防止您浪费宝贵时间试图确定样品制备条件或蛋白质印迹条件是否最佳的工具。CST 科学家已经找出为提供细胞死亡响应信号稳健的各种细胞提取物所需的样品处理、制备和收集条件，因此您不必寻找——让您安安心心：您的数据解释正确。

其他资源

• 查看 CST 对照细胞提取物的完整列表。
• 根据靶标查找推荐的控制治疗方法。
• 对于您的实验中使用哪些对照细胞提取物仍有疑问吗？联系 CST 技术支持。
• 有关更多小窍门，请参阅蛋白质印迹法应用指南。

选择以下参考文献 

1. Favaloro B, Allocati N, Graziano V, Di Ilio C, De Laurenzi V. Role of apoptosis in disease. 
   Aging (Albany NY). 2012;4(5):330-349. doi: 10.18632/aging.100459
2. Eischen CM, Kottke TJ, Martin LM 等人Comparison of apoptosis in wild-type and Fas-resistant cells: chemotherapy-induced apoptosis is not dependent on Fas/Fas ligand interactions. Blood. 1997;90(3):935-943
3. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I 等人Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479-489. doi:10.1016/s0092-8674(00)80434-1
4. Yang Y, Klionksky DJ. Autophagy and disease: unanswered questions. Cell Death Differ. 2020;27(3):858-871. doi:10.1038/s41418-019-0480-9
5. Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010;140(3):313-326. doi:10.1016/j.cell. 2010.01.028
6. Doblado L, Lueck C, Rey C 等人 Mitophagy in Human Diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(8):3903. Published 2021 Apr 9. doi:10.3390/ijms22083903
7. Wang XZ, Kuroda M, Sok J. 等人 Identification of novel stress-induced genes downstream of chop. EMBO J. 1998;17(13):3619-3630. doi.1093/emboj/17.13.3619