CST 博客: 实验室展望

Cell Signaling Technology (CST) 官方博客,在这里我们讨论您在实验台前工作时的期望,分享贴士、技巧和信息。

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了解细胞周期停滞发生的时间和原因对许多研究领域都至关重要,这些领域包括(但不限于)发育、衰老和癌症研究。

我们都知道,工具越好,产生的结果就越好,因此确保您有“衰老研究的十大靶标清单”中的所有基础工具。

编号 1:β-Galactosidase Staining Kit

衰老细胞是以 pH 依赖的方式表达 β 半乳糖苷酶,特别是在 pH 值为 6 时是可检测到的1。我们全面的 Senescence β-Galactosidase Staining Kit #9860 包含检测 pH 值为 6 时细胞中甚或冷冻组织中 β-半乳糖苷酶活性所需的一切。它非常适合快速便捷地检测多个细胞群或组织样品,方向简单明了,并且蓝色染色明亮清晰。

β Galactosidase Staining Kit

使用 Senescence β-Galactosidase Staining Kit #9860,在 pH 值 为 6 时,对细胞群倍增数为 29(左图)的正常 WI38 细胞以及细胞群倍增数为 36(右图)的衰老 WI38 细胞进行 β-半乳糖苷酶染色。

编号 2:p53磷酸化 53

p53 研究很广泛,几乎不需要介绍了!作为 DNA 损伤反应 (DDR) 通路的主要参与者p53 肿瘤抑制蛋白也是细胞周期的关键调节因子,其中积累的磷酸化 p53 将促使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 (CDKI) 的激活并最终导致细胞周期停滞。对 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析

使用 p53 (7F5) Rabbit mAb(绿色) 对 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 DY-554 Phalloidin 进行标记(红色)。

正如上面所述的,衰老细胞周期停滞高度依赖于phospho-53,而phospho-53 会聚集并激活多种不同的 CDKI。在 p53 和phospho-p53 水平之间进行比较分析通常是研究 DDR 通路和衰老的一个关键步骤。

对 MCF-7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。

使用 Phospho-p53 (Ser46) Antibody (绿色) 对未经处理 (左图) 或 Etoposide (右图) 处理的 MCF-7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 DY-554 Phalloidin 进行标记(红色)。

编号 3:p21

其中一个确立已久的衰老标记物 p21 是磷酸化 p53 的下游 CDKI。p21 通过在结合 CDK2 时阻断细胞周期进入 G1/S 来起到细胞周期抑制剂的作用 (1)。

对 MCF7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析

使用 p21 Waf1/Cip1 (12D1) Rabbit mAb(红色)和 Phospho-Histone H3 (Ser10) (6G3) Mouse mAb #9706(绿色)对 MCF7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

编号 4:p16

另一种常见且可靠的衰老标记物 p16 的表达被认为会促使细胞衰老2。p16 是 CDKI INK4 家族的成员,它会与 CDK4 和 CDK6 作用使细胞周期停滞在 G13

对 HUVEC 细胞的提取物进行蛋白质印迹法分析

使用 p16 INK4A (D3W8G) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457 (下图)对 HeLa 和 HUVEC 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

编号 5:LaminB1

衰老细胞通常显示出形态变化,使得 LaminB1 成为另一个有用的衰老指示分子。胞核形态标记物 LaminB1 在衰老的人和小鼠细胞中出现表达缺失4。LaminB1 缺失以及 p21p16 聚集的增加均是重要典型的衰老标志。

使用 Lamin B1 和 β-肌动蛋白对 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析

使用 Lamin B1 (119D5-F1) Mouse mAb(绿色)和 β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #8584(红色)对 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087(DNA 荧光染料)。

编号 6:   衰老相关分泌表型 (SASP)

衰老细胞有许多常见特征,但这些特征不尽相同。每个衰老细胞群表现为细胞因子、生长因子和蛋白酶水平不同;这称为衰老相关分泌表型 (SASP)。SASP Antibody Sampler Kit 含有针对各种蛋白的大量抗体系列,可用于研究衰老细胞。这个系列可以让您确定特定于您的细胞群的 SASP。

对重组人 Interleukin-1β 进行蛋白质印迹法分析

使用 IL-1β (D3U3E) Rabbit mAb 对重组 Human Interleukin-1β (hIL-1β) #8900 进行蛋白印迹分析。

编号 7:Rb磷酸化 Rb

通常,Rb 磷酸化是解除转录靶标抑制并推进细胞周期进程所必需的。各种 CDKI(包括 p21p16)对细胞周期的抑制会导致 Rb 被过度激活;这最终会导致细胞周期停滞和衰老4

SH-SY5Y 细胞的共聚焦免疫荧光图像

使用 RB (4H1) Mouse mAb(绿色)对 SH-SY5Y 细胞进行共聚焦免疫荧光图像分析。肌动蛋白丝用 Alexa Fluor 555 phalloidin(红色)标记。

Rb 必须经过磷酸化才能推进细胞周期进程,因此在衰老细胞中未见磷酸化-Rb。与 p53 一样,在研究衰老时,对 Rb 和磷酸化 Rb 进行比较分析是最重要的。

对 MCF7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析

使用 Phospho-Rb (Ser807/Ser811) (D20B12) XP® Rabbit mAb(绿色)对未经(上图)或已经 λ 磷酸酶(下图)处理的 MCF7(左图)和 BT-549(右图)细胞进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin(红色)标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ® #4084(DNA 荧光染料)。

编号 8: γ-H2A.X

γ-H2A.X 是 DDR 通路的一种典型标志物。DNA 损伤会导致快速可靠的应答,其中 H2A.X 在 Ser139 上被磷酸化,形成 γ H2A.X (5),使其成为一种研究 DDR 通路和衰老的强大工具。

使用 Phospho-Histone H2A.X 对未经处理或经过紫外线处理的石蜡包埋的 HT-29 细胞进行免疫组织化学分析

使用 Phospho-Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb 对未经处理的(左)或经紫外线处理(右)的石蜡包埋的 HT-29 细胞进行免疫组织化学分析。

编号 9:53BP1

53BP1 最初被确定为 p53 的结合伙伴,并建议增强其转录活性6, 7。53BP1 在 DNA 修复中起到重要作用;已知会被募集到 DNA 损伤位点,53BP1 是否停留在这些位点取决于 γ-H2A.X8

使用 53BP1 Antibody 对 Hela 细胞进行共聚焦免疫荧光分析

使用 53BP1 Antibody(绿色)对 Hela 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 Alexa Fluor® 555 phalloidin(红色)标记。

编号 10: Ki67

有时,检测某种物质的最佳方式是确定未起作用的物质。Ki67 是一种胞核蛋白,它也是一种频繁使用的细胞增殖标志物。这种检测横跨 G1 至有丝分裂结束,但在细胞处于 G0 休止期时无法检测到9。衰老细胞的标志是永久性退出细胞周期,因此衰老细胞不表达 Ki67。

使用 Ki67 对人乳腺导管癌组织进行免疫组织化学分析

使用 Ki-67 (8D5) Mouse mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析。

衰老研究的抗体选择 

有很多衰老细胞标志物,那么为什么只选择一个呢?我们建议从 Senescence Marker Antibody Sampler Kit 开始,这款试剂盒含有这些功能性标记物中的多个标记物,非常适合用来检测您的衰老细胞! 

您还可以参考我们相互作用的 DNA 损伤反应 (DDR) 通路,以帮助识别相关靶标。

 

选择参考文献:

  1. Hernandez-Segura A, Nehme J, Demaria M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 2018;28(6):436-453. doi:10.1016/j.tcb.2018.02.001
  2. LaPak KM, Burd CE. The molecular balancing act of p16(INK4a) in cancer and aging. Mol Cancer Res. 2014;12(2):167-183. doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0350
  3. He S、Sharpless NE。Senescence in Health and Disease. Cell. 2017;169(6):1000-1011. doi:10.1016/j.cell.2017.05.015
  4. Gorgoulis V, Adams PD, Alimonti A, et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell. 2019;179(4):813-827. doi:10.1016/j.cell.2019.10.005
  5. Sharma A, Singh K, Almasan A. Histone H2AX phosphorylation: a marker for DNA damage. Methods Mol Biol。2012;920:613-626. doi:10.1007/978-1-61779-998-3_40
  6. Iwabuchi K, Bartel PL, Li B, Marraccino R, Fields S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(13):6098-6102. doi:10.1073/pnas.91.13.6098
  7. Ward IM, Minn K, Jorda KG, Chen J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J Biol Chem. 2003;278(22):19579-19582. doi:10.1074/jbc.C300117200
  8. Wang B, Matsuoka S, Carpenter PB, Elledge SJ. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 2002;298(5597):1435-1438. doi:10.1126/science.1076182
  9. Lawless C, Wang C, Jurk D, Merz A, Zglinicki Tvon, Passos JF. Quantitative assessment of markers for cell senescence. Experimental Gerontology. 2010;45(10):772-778. doi:10.1016/j.exger.2010.01.018

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