比最高引抗体更优秀的Myc-tag克隆：9B11

生物研究是为了扩展知识面，因此科学家们对抗体尚未被开发出来的蛋白的研究感兴趣并不少见。那么，科学家们如何对这些新型或表征不那么清晰的蛋白进行机理研究呢？表位添加是这些蛋白研究的一个强大工具，并且可用于各种各样的实验。但表位标签的选择以及抗体的选择和验证均需谨慎。

对转染 Myc 标签蛋白（绿色）的 COS 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalloidin #13054（红色）标记。蓝色假色 = DRAQ5^® #4084（DNA 荧光染料）。

添加小表位标签 [如 FLAG 标签 (1)、6xHistidine (His) 标签 (2) 和 Myc 标签 (3)] 的重组融合蛋白的表达可以让蛋白通过抗体被检测到。应始终根据目标蛋白优化附加某个表位标签的过程；这包括通过严格的实验设计和确认来确保表位融合不会干扰蛋白结构、稳定性或功能。但在验证某个新附加了表位的蛋白时，还应考虑标签的可及性，因为它们必须在被融合的蛋白背景下来操作。同样地，周围的蛋白环境可能会影响抗体与表位之间的相互作用。此外，表位可融合至氨基末端或羧基末端，甚至插入到内部开放阅读框 (ORF)，此时两个末端的表位附加对于目标蛋白而言不具有功能作用 (4)。因此，周围的氨基酸可能会通过环境特定方式影响抗体功能。

最近，Science Signaling 中的一篇文章的作者尝试研究 Myc 标签插入位置对抗体功能的影响。他们的工作聚焦于引用最多的 Myc 抗体，即单克隆抗体 9E10。Schüchner 等人发现，在 Myc 标签序列后如果接有更小的中性氨基酸而不是一系列带有正电荷的氨基酸时，9E10 在蛋白印迹的结果会降低。与小鼠 Myc 单克隆 4A6（竞争者 A）对比发现，尽管附近的氨基酸序列有变化，但 后者Myc 标签蛋白的检测更为一致。研究人员通过进行一项微阵列分析来检测20个蛋白氨基酸为羧基末端的四个位置连接表位标签，以进一步研究这些作用。与备选单克隆抗体相比，9E10 对序列位置和环境更为敏感。9E10 的信号变化极大，19 个肽段的信号低于平均信号的 10%，9E10 无法检测到五个肽段。研究人员随后在 Myc 标签的 +1 和 +2 位置进行了双重氨基酸替代，又将 9E10 与备选 4A6 抗体进行了比较。他们发现，9E10 现在无法检测 20 个肽段，而 4A6 抗体亦无法检测任何肽段。这明显表明，表位周围不远的蛋白编码序列对 9E10 反应性至关重要。

使用 Myc-Tag (9B11) Mouse mAb 对对照（上图）或转染 Myc 标签蛋白的羧基末端（下图）的石蜡包埋的 COS 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。

为了评估这种环境依赖性序列敏感性是否是常见的，研究人员随后转而关注于其他常见的 Myc 抗体，并在蛋白印迹实验中分析了这些抗体。这些抗体包括小鼠单克隆 9E10（竞争者 A）、单克隆 4A6（竞争者 A）以及小鼠单克隆 9B11 (Cell Signaling Technology)，选择它们的依据在于引用次数、可用性和宿主动物。Myc 表位在四种不同的环境下融合 — 大鼠 PP2A B55α 片段的氨基末端或羧基末端，其中直接上游或下游序列包含七个来源于常见哺乳动物表达载体的氨基酸。将这些与小鼠单克隆抗体 2G9克隆 B55α 进行比较。作者发现，许多常见 Myc 抗体在检测四种标签蛋白的能力方面存在很大的变化性，不出所料，9E10 也包括在内。尤其是，在仅有的两种显示在检测所有四种 Myc 标签蛋白时有一致性的蛋白中，9B11 是其中一种，表明这种抗体对局部氨基酸序列环境相当不敏感。

虽然事实是表位附加方法仍是研究人员的一种必要的工具，但本篇文章表明表位标签的选择以及用来检测表位标签的抗体的选择和验证均需谨慎。虽然小鼠单克隆 9E10 目前是使用和引用最频繁的抗体，但本篇文章表明，因紧邻的氨基酸序列，它极其易受抑制。因此，研究人员将需要对其特定应用谨慎考虑抗体，并且可能关注没有相同背景敏感性的即时可用的产品。

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参考文献：

1. P. Hopp, K. S. Prickett, V. L. Price, R. T. Libby, C. J. March, D. P. Cerretti, D. L. Urdal, P. J. Conlon, A Short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Bio/Technology 6, 1204–1210 (1988).
2. Hochuli, W. Bannwarth, H. Döbeli, R. Gentz, D. Stüber, Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology 6, 1321–1325 (1988).
3. I. Evan, G. K. Lewis, G. Ramsay, J. M. Bishop, Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol. Cell. Biol. 5, 3610–3616 (1985).
4. E. Zordan, B. J. Beliveau, J. A. Trow, N. L. Craig, B. P. Cormack, Avoiding the ends: Internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics 200, 47–58 (2015).