您刚刚通过 SDS-PAGE完成裂解物样品电泳，因此，您非常有信心蛋白质应该已经以正确的分子量迁移并且准备好转移到膜上以通过蛋白质印迹法 (WB) 检测。但如果不这样做呢?
如果经过完整的实验步骤后，您的条带不在您期望的范围内，则可能需要对抗体进行故障排除，但还应该对电泳和转移步骤进行故障排除。这可以通过用 Ponceau S 或考马斯亮蓝染色来观察总蛋白。
Ponceau S Staining Solution #59803 和考马斯亮蓝染色液允许电泳后观察蛋白质转移物。它们对于确认蛋白质转移和目标靶点的存在、节省时间和实验中的宝贵资源非常重要。此外，它们显示印迹中的任何瑕疵（例如气泡和转移不匀），这些瑕疵是瞄准出版级质量图像时的重要考虑因素。
Ponceau S 和考马斯亮蓝染色都是与带正电的氨基酸基团和非极性蛋白区域结合的带负电溶液。Ponceau S 检出 200 ng 或更高的蛋白质水平且与 PVDF、硝化纤维或尼龙膜兼容。传统的考马斯亮蓝仅与 PVDF 膜兼容，但可以检出 50 ng 或更高的蛋白质水平。灵敏度较高的检测染液可能重要，这取决于样品类型和正进行的测试。但是，使用考马斯亮蓝溶液造成不可能用蛋白质印迹分析继续下去，因为溶液中存在的醇和酸导致使用后蛋白质样品在凝胶内部固定。
考马斯蓝 G-250 染色实验步骤
可用的考马斯亮蓝染色溶液有几种类型，并且实验步骤略有不同，根据供应商和溶液类型的不同，从两个小时到一整天不等。最常用之一者考马斯蓝 G-250 可以如下使用：
- 电转移后，用 ddH2O 洗涤聚丙烯酰胺凝胶三次。
- 在聚丙烯酰胺凝胶上添加至少 25mL（或直到凝胶被覆盖）染色溶液。
- 将带有染色溶液的凝胶放在摇床上，并缓慢搅拌，以防止凝胶粘附到容器上。
- 染色时间取决于凝胶厚度和丙烯酰胺的百分比。可能需要两个小时或更长时间才能在凝胶上看到均匀的蓝色。
- 凝胶已染色后，用 ddH2O 洗涤凝胶并轻轻摇一到两小时，其间更换 ddH2O 数次以去除多余的游离染料。
Ponceau S 染色实验步骤
Ponceau S 染色实验步骤大约耗时 20 分钟，无毒并且是比考马斯亮蓝更温和的解决方案。Ponceau S 染色液不固定蛋白质，从而允许染色后进行蛋白质印迹分析，这是另一个重要考虑因素。
欲使用 Ponceau S (CST #59803)：
- 电转移到膜上后，在 ddH2O 中短暂淋洗膜。
- 在室温将膜在 Ponceau S 染色溶液中孵育 5 到 10 分钟。
- 在 ddH2O 中洗涤膜 1 到 5 分钟，直到红色条带可见。
- 然后可以用 1X TBS-T 冲洗五分钟，然后在冲洗膜之前对条带进行标记或拍照。
现在可以继续进行实验，并且在阻滞步骤中会洗去 Ponceau S 的所有残留物。此外，Ponceau S 不与抗体结合相互作用。
何时使用 Ponceau S 和考马斯亮蓝
总体而言，两种实验步骤都可以帮助确保您的结果。 如果您需要检测 50-200 ng 范围内的蛋白质，则考马斯亮蓝是您的最佳选择。
但是，在 Cell Signaling Technology，鉴于 其速度、易用以及柔和而有效的性质，Ponceau 往往为我们的首选。
选择以下参考文献
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