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两种染料的传说:Ponceau S 与考马斯亮蓝

您刚刚完成了通过 SDS-PAGE 运行的裂解物样品检测,因此,您非常有信心蛋白质应该已经以正确的分子量迁移,并准备转移到膜上以进行蛋白质印迹检测。但如果不这样做呢?

20-CEP-12845 Ponceau 染色

如果经过完整的实验步骤后,您的条带不在您期望的范围内,则可能需要对抗体进行故障排除,但还应该对电泳和转移步骤进行故障排除。这可以通过用 Ponceau S 或考马斯亮蓝染色来观察总蛋白。

Ponceau S 染色液和考马斯亮蓝染色可实现电泳后蛋白质转移的可视化。它们对于确认蛋白质转移和目标靶点的存在、节省时间和实验中的宝贵资源非常重要。此外,它们在印迹中显示出任何瑕疵(例如气泡和转印不均匀),这是在获得出版质量图像时的重要考虑因素。

Ponceau S 和考马斯亮蓝染色都是带负电的溶液,它们与带正电的氨基酸基团和非极性蛋白区域结合。 Ponceau S 检测到的蛋白质水平为 200 ng 或更高,与 PVDF、硝化纤维或尼龙膜兼容。 传统的考马斯亮蓝仅与 PVDF 膜兼容,但可以检测 50 ng 或更高的蛋白质水平。 具有较高灵敏度的检测污渍可能很重要,具体取决于样品的类型和进行的测试。 但是,使用考马斯亮蓝溶液不能继续进行蛋白质印迹分析,因为溶液中存在的醇和酸会在使用后将蛋白质样品固定在凝胶中。

可用的考马斯亮蓝染色溶液有几种类型,并且实验步骤略有不同,根据供应商和溶液类型的不同,从两个小时到一整天不等。最常用的一种考马斯亮蓝 G-250 可以按以下方式使用;电转移后,用 ddH2O 洗涤聚丙烯酰胺凝胶 3 次。在聚丙烯酰胺凝胶上添加至少 25mL(或直到凝胶被覆盖)染色溶液。将带有染色溶液的凝胶放在摇床上,并缓慢搅拌,以防止凝胶粘附到容器上。染色时间取决于凝胶厚度和丙烯酰胺的百分比。可能需要两个小时或更长时间才能在凝胶上看到均匀的蓝色。凝胶染色后,用 ddH2O 洗涤凝胶,并轻轻摇动一到两个小时,两次之间将 ddH2O 换几次以去除多余的游离染料。

Ponceau S 染色实验步骤大约需要 20 分钟,并且无毒,并且比考马斯亮蓝更温和。Ponceau S 染色液不能固定蛋白质,因此可以在染色后进行蛋白质印迹分析,这是另一个重要考虑因素。

使用 Ponceau S (CST #59803),电转移到膜上后,在 ddH2O中短暂冲洗膜,室温下在 Ponceau S 染色液中孵育膜 5~10 分钟,然后在 ddH2O 中冲洗膜 1~5 分钟,直至可见红色条带。然后可以用 1X TBS-T 冲洗五分钟,然后在冲洗膜之前对条带进行标记或拍照。现在可以继续进行实验,并且在阻滞步骤中会洗去 Ponceau S 的所有残留物。此外,Ponceau S 不与抗体结合相互作用。

总体而言,两种实验步骤都可以帮助确保您的结果。 如果您需要检测 50-200 ng 范围内的蛋白质,则考马斯亮蓝是您的最佳选择。但是,在 CST,Ponceau 通常是我们的首选,因为它的速度、易用性以及柔和而有效的性质。

其他资源:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5445784/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2429581/

https://advansta.com/seeing-blue-red-coomassie-vs-ponceau-staining/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5646381/

https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011332_GelCode_Blue_Stain_Reag_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogIEdlbENvZGUgQmx1ZSBTdGFpbiBSZWFnZW50

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