如何以手动方式或自动细胞计数器准确计数细胞

在实验室，有几种情况，您需要知道给定体积中的细胞数量。以下是使用动物或人细胞系和原始样品时遇到的几种情况：

• 用质粒 DNA 或 siRNA 或 CRISPR 介导转染实验进行敲除
• 监测所培养细胞系的增殖和活力
• 细胞分瓶时，将适当数目的细胞接种到新容器中
• 临床实验室所需，例如红细胞计数

细胞计数时，确保准确度是首要要求。在这篇文章中，我们将探讨影响细胞计数准确度的变量。适用于通过手动方式和自动细胞计数器进行计数两种情况。

细胞计数方法和取样具有代表性的重要性

细胞计数可以手动方式或使用自动化方法进行。相比手动方式计数细胞，自动细胞计数器可以节省时间，手动计数通常使用血细胞计数器的特异性腔室和光学显微镜进行。但无论您使用哪种方法，适当取样将有助于确保您的细胞计数准确无误。

研究人员通常使用无菌技术从细胞培养容器取出少量样品（约10-50 μl），对样品进行细胞计数，然后处置样品。这样做的目的是维持正在增殖的细胞系无菌。任何学过统计学入门课程的人都会记起，任何基于抽样的测量的准确性都取决于样本群体是否代表主要群体。对于测量细胞，这意味着细胞需要在取样前是均一单细胞悬液，无团块或双细胞。对于贴壁细胞系，需要胰蛋白酶或其他解离方法来使其完全解离。在开始细胞计数之前，您可能需要“预取样”并使用显微镜观察您的细胞，以验证您的单细胞悬液中细胞团块或双细胞的情况尽可能少。

若不振摇，悬浮细胞系将聚集在容器底部。因此，在取出少量供取样之前，需要小心地上下抽吸悬液体积，重复几次，以重悬贴壁细胞系和悬浮细胞系。这有助于确保样品有代表性并改进细胞计数准确度。

使用自动细胞计数器

经过一些演进技术^{2, 3}，现在许多制造商可以提供不同自动细胞计数器，经历这些年，后者已在细胞培养场景中越来越普遍地使用。一些计数器有一个需要在各次使用之间清洁的可复用样品室，而另一些计数器使用一次性样品室或载玻片。一些仪器使用电阻抗计数细胞，而其他仪器基于成像原理，这种方法也可能提供诸如使用荧光染料或比色染料的活力测量或表型测量等功能。例如，台盼蓝常在人工计数中用于评估活力（参见以下关于台盼蓝的部分），许多自动化系统与带负电荷染料兼容。 

细胞计数器在占地面积（大小）、复杂性、功能和成本上也差异很大。如果您正使用自动细胞计数器，请熟悉制造商的相关说明：如何制备样品、加多少量、对细胞类型的特殊要求以及优化软件或仪器的设置（如成像焦点和曝光）。

使用血细胞计数器

如果您的设施中无自动化系统可用，可以使用可复用或一次性血细胞计数器进行手动细胞计数，这种计数器具备两个蚀刻有网格的腔室。细胞悬液因网格和盖玻片之间的毛细管作用被吸入腔室，从而形成薄层。网格的精确量值和腔室高度决定已知的体积大小。并使得计算细胞密度成为可能。

注： 血细胞计数器盖玻片略厚于免疫组织化学测定法和免疫细胞化学测定法所用的玻璃盖玻片类型，且形状相异。

如果使用可重复用血细胞计数器，请务必保持血细胞计数器和盖玻片清洁，并小心操作，若不慎掉落，它们很容易破裂。使用前，用镜头纸擦拭血细胞计数器和盖玻片，移除容易干扰细胞计数的灰尘和颗粒，并将盖玻片在腔室上方对齐。

用于真核细胞培养物的典型网格模式是 Neubauer 室（图 1）。血细胞计数器有两个侧面，每侧有一个 3x3 主正方形网格。每个大正方形为 1 mm x 1 mm，腔室的高度也为 0.1 mm，因此每个正方形上方的液体体积为 0.1 μL。低倍显微镜（通常为 10 倍）物镜将允许其中一个正方形位于视野中。 

图 1. 双侧血细胞计数器的每个侧边都蚀刻有九个主正方形 (1 mm) ，每个正方形对应 0.1 μl 体积。对于大多数细胞系，可使用角部正方形中计数，对于较小的细胞（例如红细胞），在更高放大倍数下，使用中心方块中计数。

要以手动方式计数细胞，机械式或数字式检尺计数器很有用。如果您要进行活细胞/死细胞计数（图 2），带有两个（或更多）键的差分计数器也管用，这样您可以同时计数多个细胞群。

图 2. 一个简单的检尺计数器（左图）和一个差分双键计数器（右图）。

血细胞计数器细胞计数：该计数了！

为此，将血细胞计数器上的盖玻片对齐，并使用移液管加载建议体积的未标记悬液或台盼蓝标记悬液。您应看到液体的弯液面在网格中行进，超过每个侧边，但勿过度填充。过多的液体改变腔室内部高度/体积，并可能导致错误计数。 

从角部的一个正方形开始。这个正方形细分成 16 个较小正方形组成的 4x4 网格。使用手动检尺计数器，计数一个较小正方形中的细胞，并以一种模式（例如上行、从左到右、下移一行、从左到右等）计数所有 16 个正方形中的细胞。为了避免重复计数，设置一个规则，如“接触小正方形右侧边界或底部边界的细胞需计数，接触小正方形左侧边界或顶部边界的细胞不需计数”，保证对每个正方形中都遵循该规则（图 3）。

图 3. 一个 1 mm 的主正方形（在左侧面板中圈出）在中央面板中放大。左上角小正方形进一步放大，右侧显示细胞。在这个例子中，我们设置了一个规则来计算，即对小方块内部的活细胞和死细胞，以及接触右边界和下边界的细胞进行技术，对接触左边界和上边界的细胞不计数。因此，此简图中的正确计数是 10 个活细胞和三个死细胞。

每次只对一个大正方形（1 mm）计数。如果使用台盼蓝（请参阅以下关于台盼蓝的部分）和简易检尺计数器，请首先计数未染色的活细胞，记录总数，然后重置计数器并计数蓝色（死）细胞，再次记录总数，之后转移到下一个大正方形。如果使用双键计数器，您可以使用该计数器在一个信道计数活细胞并随着您推进，在另一个信道计数死细胞。无论哪种方式，写下每个大正方形的总数，重置计数器，然后转移到下一个正方形。完成后，计算每个大正方形的平均活细胞数和每个大方块的平均死细胞数。 

常见方法是对血细胞计数器一侧上四个角部大正方形（1 mm）中的细胞进行计数，但您也可以对八个大正方形（从血细胞仪的两侧）或任意个数的大方块计数。如果细胞密度较高，可使用较少数目的正方形，如果细胞密度较低，可使用更多正方形获得准确的平均值。如果密度太高以至于您必须计数成百个细胞，可试着进一步稀释悬液、清洁血细胞仪，并进行另一次计数。

细胞活性：用台盼蓝区分活细胞与死细胞

经常通过计数活细胞和死细胞以评估细胞活力。跟踪随时间推移的细胞活力率也是个好做法，以防您的培养物出现某些可能潜在影响您实验结果的问题。惯例性使用的活力测量方法是台盼蓝拒染法。膜完好无损的活细胞会排斥台盼蓝染料进入细胞，并且会显得透明/未染色。细胞膜破裂的死细胞和垂死细胞将让台盼蓝进入细胞浆并呈现蓝色。

进一步阅读：何谓细胞活力？可以怎样测量？

台盼蓝可从各种来源获得。请参阅制造商的说明，了解溶液与细胞样品融合所需要的染液量以及孵育多长时间后测量活力（使用自动方法或手动方法）。在 CST 的细胞培养室中，我们将 10 μl 0.4% 台盼蓝添加到 10 μl 细胞样品，之后计数。请记录稀释倍数，因为将需要这个倍数反算样品中细胞的原始密度。

注：台盼蓝标记也可用于评估细胞通透作用，而不是细胞活力。例如，在 CST CUT&RUN 实验步骤中，台盼蓝染色用于确认细胞经充分透化，从而使抗体和酶等试剂将能够接触到并结合胞核内部的染色质。

计算细胞密度

欲计算以细胞数/mL 计的细胞密度，求得每个大正方形的平均细胞计数并乘以 10 ⁴（请记住，一个大正方形的体积为 0.1 μL，或 0.0001 mL = 1x10^-4 mL），然后乘以稀释倍数。

例如，假设我们计数了八个大正方形，并记录以下总数：

要计算每个正方形的平均活细胞数目：

495 个细胞 ÷ 8 个正方形 = 61.875 个细胞/正方形

接下来，将该数字乘以 10⁴，然后乘以 5，因为在这个例子中，细胞用台盼蓝标记时按 1:5稀释： 

61.857 个细胞 x 10⁴ x 5 = 309.375 x 104 个细胞/ml = 3.094 x 10⁶ 个细胞/ml（四舍五入）

这是活细胞密度。如果接种新鲜平板，依据细胞培养皿面积，使用此数值计算出所需接种的体积。 

计算活力百分比

若要进一步计算活力，首先加合活细胞和死细胞，计算得到细胞总数为535个。然后活细胞数除以细胞总数，以得到活力百分比：

495 ÷ 515 = 0.961 = 96.1%

因细胞系和分瓶方法的区别，活力基线可能更高或更低。最好在你的实验室笔记本或细胞培养记录本中写下细胞活力，以供您监测随时间推移的细胞活力。 

计数完成后，取出盖玻片，向血细胞计数器和盖玻片上喷洒或挤出 70% 乙醇流以杀死细胞，然后擦拭干净。在 DI H₂O 中淋洗血细胞计数器和盖玻片，然后擦干。用镜头纸再擦拭一次，然后将血细胞计数器和盖玻片包裹在镜头纸中，并存放在箱或盒中。

选择以下参考文献

1. Stevenson K, McVey AF, Clark IBN, Swain PS, Pilizota T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Sci Rep. 2016;6:38828. 2016 年 12 月 13 日发布。 doi:10.1038/srep38828

2. Smith C. Counting cells by manual and automated methods. Biocompare. https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/593111-Counting-Cells-by-Manual-and-Automated-Methods/. 2023 年 1 月 3 日发布. 访问时间 2023 年 4 月 25 日.

3. Easthope E. Accurate cell counting. Biocompare. https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/347331-Accurate-Cell-Counting/. 2018 年 3 月 14 日发布. 访问时间 2023 年 4 月 25 日.

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