Validating a Phospho-Tau 217 Antibody for Alzheimer’s Disease Research

截至 2025 年，阿尔茨海默病 (AD) 将影响全球超过 710 万名 65 岁以上的人，因此，开发能够促进新突破并面对这种毁灭性神经退行性疾病有所作为的工具是至关重要的。¹ 目前，检测和评估 AD 依赖于昂贵且侵入性脑脊液 (CSF) 生物标记物测量和神经成像技术，研究人员长期以来等待一种基于血液的可靠 AD 生物标记物出现，从而能够实现早期检测、监测和研究。近几十年来，越来越明确的是，磷酸化 tau 蛋白可能正是这把钥匙。²

在人 tau 蛋白上的众多磷酸化位点当中，苏氨酸 217 (p-tau217) 特立独行。该位点处的磷酸化有望作为为一种基于血液的生物标记物，因为其水平在常染色体显性遗传 AD 患者中增长，³从而与其他 tau 磷酸化位点相比，使得区分 AD 患者和非 AD 患者成为可能。^4,5 还已经证明，p-tau217 的血浆水平升在 AD 早期阶段升高，这表明它可能是一种辅助于 AD 纵向研究和药物开发以及诊断、疾病监测和患者护理的有前景生物标记物。^6,7

阿尔茨海默病状态_磷酰 tau 图

阿尔茨海默病中的 Tau 过度磷酸化。 Tau 是一种微管相关蛋白 (MAP)，表现出改变和增加的磷酸化模式，这归因于 tau 激酶/磷酸酶活性变化。这削弱了 tau 使微管稳定的能力，导致微管灾难加剧和载货转运受损。Tau 的病理性过度磷酸化使其更易聚集为成对的螺旋纤丝，这些纤丝形成庞大的胞内神经原纤维缠结 (NFT)，这是在患病组织中可见的一个显著 AD 标志。微管去稳定化和 NFT 都促成与 AD 和 Tau 蛋白病相关的神经毒性和神经退行性疾病。使用本贴文末尾的链接下载海报，查看此图的高分辨率版本。

我与神经科学部门的研究人员合作开发了一种用于检测 tau 上必需苏氨酸 217 磷酸化位点的单克隆抗体。在测量诸如 p-tau217 等基于液体的生物标记物时，重要的是，抗体对靶标高度特异且灵敏，确保其在诸如酶联免疫吸附测定 (ELISA)、单分子阵列和免疫沉淀质谱 (IP-MS) 等实验中效果良好。

我们得到的单克隆抗体克隆准确检出人/啮齿动物组织和血浆中的 p-tau217，与市售的竞品抗体相比，表现出优异的亲和力和结合动力学。以下 CST 产品中提供了克隆 E9Y4S：

继续阅读以更多了解我公司磷酰 tau 抗体产品的开发和验证及其对 AD 研究的适用性。

Developing a Monoclonal Antibody Clone for Phospho-Tau 217

开发一种对苏氨酸 217 处磷酸化的 tau 灵敏且特异性的抗体，需要深刻的科学专业知识、时间、精力、资源以及许多人的协作努力。在此过程期间，我们使用 ELISA/点印迹法和蛋白质印迹分析法评估了包含近一千种针对 p-tau 肽和 tau 表达组织（+/- λ 磷酸酶）的抗体克隆库。我们鉴定到克隆 E9Y4S，将其扩充并重组表达，以进一步检查和表征。

确定抗体特异性

在 CST，我们严肃对待抗体特异性，并且我们对年复一年作为引用次数最多的研究用抗体供应商引以为傲。我们知道，至关重要的是，我们的所有抗体都应准确、可靠地发挥作用，从而您才可以信任结果并推进您的研究项目。确保我们的 p-tau217 抗体产品有特异性，这并非通过一次实验就实现，而是使用多种技术以多种不同方式做到。

我们进行了以下实验来检验不同类型的特异性，包括磷酰特异性、位点特异性和靶标特异性：

通过以下方式确认磷酰特异性，即对翻译后修饰 (PTM) 的特异性：用 λ 磷酸酶处理小鼠脑裂解物，这消除蛋白质上的磷酸化并导致抗体信号丢失。
使用针对多个独立磷酸化位点的合成肽，通过点印迹测定法确定位点特异性。这确认了抗体检测苏氨酸 217 处磷酸化的能力。
通过将野生型小鼠脑组织与 tau 敲除模型比较演示了靶标特异性，确保抗体与 tau 特异性结合。

通过 IP 进行额外验证，然后是 WB，以检查 tau 蛋白的富集情况。用阿尔茨海默病脑样品测试确认了该抗体适用于真实世界研究场景。这些模型中所见的增强信号进一步展示了抗体的相关性和特异性。

以下图展示了我们为验证克隆 E9Y4S 的磷酰特异性、位点特异性和靶标特异性所进行的一些实验：

Phospho-Tau 217 antibody: phospho-specificity site-specificity target specificity 确定磷酰特异性、位点特异性和靶标特异性。(A) 对小鼠脑裂解物 -/+ λ 磷酸酶处理的比较显示 E9Y4S 有磷酰特异性。(B) 野生型 (WT) 小鼠脑与已确认的 tau -/- 小鼠脑的比较显示针对 tau 的靶标特异性。(C) 小鼠脑组织提取物中 Tau Thr217 的 IP 与输入相比显示富集。(D) 使用研究相关模型系统确认靶标特异性，其中与对照皮层相比，在 AD 皮层/海马中检出增强的 p-tau217 信号。(E) 肽点印迹免疫测定法通过比照非磷酸化对照和周围磷酸化位点比较，证明针对苏氨酸 217 的特异性。

抗体亲和力和结合动力学的表征

除了知晓抗体将在批准的测定法中表现之外，研究人员还可能发现了解抗体如何与其靶标表位强力结合（即抗体的亲和力）是有益的。知晓抗体的亲和力可能在预测抗体如何在多种测定法中表现方面有价值。例如，测量启-闭速率来确定抗体的动力学可以了解该抗体与其他抗体配对的兼容性，这在诸如 ELISA 等基于成对的测定法中重要。亲和力和动力学信息也可能用于比较诸供应商之间市售抗体的潜在性能。

在 Octet RED96 (Sartorius) 上使用生物层干涉法 (BLI) 测量了 Phospho-Tau (Thr217) (E9Y4S) Rabbit mAb 和一种市售竞品单克隆抗体的结合动力学。将生物素化的 Tau 217 或 p-tau217 肽接合到高精度链霉亲和素生物传感器上，并暴露于不同浓度的 CST 抗体克隆或该竞品单克隆抗体，如下图中所示。

CST 抗体克隆的的结合率更高和解离率更低，表明相比竞品抗体，我们的抗体对 p-tau217 肽既有更高的亲和力，又有更稳定的结合作用。

CST 抗体克隆（左）与竞品单克隆抗体（右）比较的 BLI 数据。与 p-tau217 肽的结合以红色显示，与非磷酸化肽的结合以蓝色显示。受测浓度是 250 nM 至 3.9 nM。使用二价分析物模型进行全局曲线拟合；仅显示通过该拟合的浓度。

在 ELISA 中使用 Phospho-Tau (Thr217) (E9Y4S) Rabbit mAb

虽然蛋白质印迹法、IP 和 BLI 都提供了有用的信息，但 ELISA 的灵敏度和易用性赋予其更大的生物流体样品检测实用性。我们使用了克隆 E9Y4S 开发 Phospho-Tau (Thr217) Matched Antibody Pair #70933、PathScan^® RP Phospho-Tau (Thr217) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #87749 和 PathScan^® RP Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672。我公司 PathScan RP 试剂盒的主要优势在于它们只需要 15 分钟的手动操作时间，并且可以在短短 1.5 小时内生成结果。

博客：保障数据质量：确保 ELISA 批次间可重复性

使用 PathScan^® RP Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672，我们能够检出啮齿动物脑组织中的 p-Tau217，并确定与非患病对照组相比，人 AD 脑组织中 p-tau217 水平升高，如以下所示。

PathScan RP Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672 的评估

PathScan^® RP Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672 的评估。 (A) 使用指定浓度的重组 Tau 蛋白测量 #59672 的灵敏度。(B) 使用小鼠脑组织在指示的裂解物蛋白滴定度（+/- λ 磷酸酶）测量脑组织中 #59672 的磷酰灵敏度。(C) 使用 #59672 测量啮齿动物大脑（+/- λ 磷酸酶）和人 AD/对照大脑中 p-Tau217 的相对水平。

PathScan^® RP Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672 还允许与 WT 对照组相比，检出 TauP301S 转基因小鼠模型血浆中升高的 p-tau217 水平，如下图中所示。综上所述，这些数据表明我们鉴定的 p-Tau217 ELISA 对子和测定法可用于检测研究目的用生物流体中的 p-Tau217 。

使用血浆样品验证 PathScan Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672

使用血浆样品对 PathScan^® Phospho-Tau (Thr217) Sandwich ELISA Kit #59672。#59672 的验证区分了相比对照小鼠 (非 Tg) ， 3 月龄 Tau P301S 小鼠 (Tau) 的血浆中 tau 在 Thr217 处的磷酸化。数据由 Ping-Chieh Pao 博士和 Li-Huei Tsai 博士（麻省理工学院）提供，并经许可使用。

您可以信赖的抗体

我们进行的严格实验（如本文中所述的那些）是我们为何可以自信地保证 CST 抗体将在预定使用它们的测定法中如预期发挥作用的原因。我们的高灵敏度、高特异性 Phospho-Tau (Thr217) (E9Y4S) 兔单克隆抗体以高亲和力和强力结合动力学与 p-tau217 结合，从而您知道自己可以首次及次次信任自身结果。

在 SfN 2023 上展示的海报中更多了解我们为验证克隆 E9Y4S 可用于 WB、IP 和 ELISA 所进行的实验：

其他资源：

选择以下参考文献

Gilster SD, Boltz M, Dalessandro JL. Long-Term Care Workforce Issues: Practice Principles for Quality Dementia Care. Gerontologist. 2018;58(suppl_1):S103-S113. doi:10.1093/geront/gnx174
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CST 博客：实验室展望

解密阿尔茨海默病：Developing a Phospho-Tau 217 Antibody