验证单克隆抗体的 ADP-核糖基化翻译后修饰 (PTM)

蛋白质腺苷二磷酸或 ADP-核糖基化是一种有趣的翻译后修饰 (PTM)，存在于所有生命界中。¹ 自从 60 多年前 Pierre Chambon 发现它以来，² 科学家们已经表征了 ADP-核糖基化在诸如 DNA 损伤修复和稳态³、细胞骨架组装⁴、先天免疫⁵ 和 rRNA 生物合成等过程中的相关性。⁶ 由于其在这些主要细胞过程中的作用，ADP-核糖基化是一个有希望的治疗用干预靶标，并作为一种癌症治疗策略而受到关注。

我们最近发布了一种用于检测 ADP-核糖基化修饰的兔单克隆抗体。该产品可按以下几种样式提供：

• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) #29889
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #88873
  

一直在增加更多抗体制剂！查看 CST 产品目录，获取此 ADP-核糖抗体克隆的最新产品列表。 

与我们的革命性 PTMScan^® 产品类似，该克隆可以独立于周围的氨基酸环境识别 ADP 核糖基化 PTM，并且还与物种无关。因此，该克隆可以检测出这种独特的 PTM，无论它出现在谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸还是其他残基上。这种多功能性使其用于研究任何给定生物样品中所有的 ADP-核糖基化情形。

此外，当抗体克隆以单个 ADP-核糖 (ADPr) 单元（称为单 ADP-核糖基化（MAR 或 MARylation））或 ADP-核糖单元链（称为多 ADP-核糖基化（PAR 或 PARylation））的形式附着于蛋白质时，它可以检测到 ADP-核糖基化。 

抗原识别基础如此广泛下，如何评估我们抗体克隆的 ADP-核糖基化特异性？

验证 CST 单聚/多聚 ADP 核糖基化抗体

作为科学家，我们切身了解，拥有自己可以信赖的抗体对推动研究发展至关重要。这就是为什么我们对抗体验证非常重视，并保证在我们为某个特定应用验证抗体时，它能在第一次使用时就有效，并且每次使用都能正常发挥作用。 

开发高度特异性的 ADP-核糖基化抗体需要广泛的科学专业知识、时间、投入、资源以及来自公司蛋白质组学部门众者的合作。与所有 CST 抗体验证活动一样，利用多项实验确认抗体特异性，这包括以下三种策略：

• 诱导 MAR/PAR 的二元模型
• 阻断 MAR/PAR 诱导作用的二元模型
• 移除 MAR/PAR 的酶促模型

单独使用这些策略中的任何一种都可以测试抗体特异性，但综合而言，诸如这样的验证活动使我们能够保证 CST 抗体按预期发挥作用。您可以阅读下文，更多了解这三种实验。

MARylation 和 PARylation 的实验诱导和抑制

为诱导 PAR，我们用过氧化氢 (H₂O₂) 处理样品。过氧化氢通过 MAPK8（也称为 JNK1）易位到细胞核中来诱导 PAR，在细胞核中，MAPK8 磷酸化并激活生成 PAR 的酶 PARP1。⁷ 

相反，他拉唑帕利 处理抑制了 PAR。这种化学物质既充当 PARP 催化抑制剂，又充当 PARP“陷阱”——它将 PAR 生成酶 PARP1 固定至双链 DNA 断口，从而防止 H₂O₂ 介导的 PAR 诱导。³

图 1 中的蛋白质印迹检测显示了诱导 MAR/PAR 和阻断 MAR/PAR 诱导的实验。

图 1.未处理 (-) 或经 H₂O₂ 或他拉唑帕利处理 (+) 的 Hela 细胞的蛋白质印迹分析。 

在另一项实验中，聚 ADP 核糖糖基水解酶 (PARG) 用来移除 ADP 核糖基化。PARG 将 PAR 修剪成 MAR，并降低 H₂O₂ 处理的细胞中的 PAR 信号（图 2）。

图 2. 过氧化氢诱导 HeLa 细胞中的 PAR 化信号（左图）并用重组人 PARG 移除 PAR 化信号（右图），其中 IF 检测使用了 Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190（绿色）、β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700（红色）和 DAPI #4083（蓝色）。

使用这些实验模型，我们验证了这种新的 PTM 抗体克隆在蛋白质印迹 (WB) 应用和免疫荧光 (IF) 应用中的用途。

治疗潜力：单聚 ADP 核糖基化与多聚 ADP 核糖基化中的 PARP 酶

在诸多胞核过程中，经常强调对 PAR 的调节，因此认为 MAR 在功能上反映 PAR 将是合乎情理的。然而，事实并非如此，某种混淆可能归因于形成这种有趣 PTM 的 PARP 酶家族共享的名称。 

聚 ADP 核糖聚合酶 (PARP) 家族的蛋白质共享一个将 ADP 核糖基从 NAD+ 转移到靶标蛋白的催化结构域。存在17 种已知的人 PARP 酶 “撰写器”，它们可以如下诱导 PAR 或 MAR： 

• PARP 1、PARP 2、PARP 4、PARP 5A 和 PARP 5B 添加 ADP 核糖的长链 (PAR化)。
• PARP 3、PARP 4、PARP 6、PARP 7、PARP 8、PARP 10、PARP 11、PARP 12、PARP 14、PARP 15 和 PARP 16 参与添加单个 ADP 核糖单元 (MAR 化)。
• PARP4 能够既使底物 MAR 化，又使其 PAR 化。  

一个其中 MAR化 与 PAR化不同的情形是在细胞骨架调节中。这里，PARP 7 介导的 α-微管蛋白的 MAR 化导致胞浆中微管解聚。⁴

探索 CST 产品目录中的相关 PARP 抗体产品。

为了区分 MARylation 和 PARylation，可以采用使用 PARG 共同处理的检测工作流程实验步骤，如图 2 所示。这种处理去除了 PAR 但不去除 MAR，可以与 CST ADP-核糖基化抗体克隆一起在 WB 或 IF 中使用，以进一步研究 MAR 与 PAR 的独特功能。

癌症治疗中的 PARP 抑制剂

在过去十年，PARP 家族已经引起在抗癌战斗中寻找新靶标的肿瘤学家注意。 

由于成功的 DNA 修复需要功能性 PAR 化，因此可以在联用 PARP 抑制剂诱导双链断口的癌症治疗（如铂基疗法）中利用这种要求。这使 DNA 在遭停滞的复制分叉处未修复，并诱导基因组不稳定性。 

多项临床试验已展示 PARP 抑制剂在胰腺癌、小细胞肺癌以及卵巢癌和乳腺癌中的效力，无论 BRCA1 状态如何。⁹ 截至 2024 年，美国 FDA 已批准四种 PARP 抑制剂（奥拉帕利、卢卡帕利、尼拉帕利 和 他拉唑帕利）用于治疗卵巢癌、输卵管和原发性腹膜癌以及 HER-2 阴性乳腺癌。

作为具有深远临床意义的生物学核心 PTM 之一，看看 ADP 核糖基化研究引领我们走向何方将令人期待。

相关产品和进一步阅读

探索 CST 的相关 PARP 抗体产品，以助力您的 MAR 化或 PAR 化研究：

• PARP (46D11) Rabbit mAb #9532（经验证用于 WB、IP 和 eClip）

• PARP Antibody #9542（经验证用于 WB）

• PARP (46D11) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) #17245（经验证用于 WB）

• PARP (46D11) Rabbit mAb (Sepharose^® Bead Conjugate) #6704（经验证用于 IP）

请阅读以下博客，更多了解 CST 基序技术：蛋白质组学分析的革命：20 年后的 PTMScan

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CST 蛋白质组学部门的首席科学家 Barry M. Zee 博士和 Jeff Silva 博士以及科学内容营销作家 Alexandra Foley 参与撰写了这篇博文。

选择以下参考文献

1. Perina D, Mikoč A, Ahel J, Ćetković H, Žaja R, Ahel I. Distribution of protein poly(ADP-ribosyl)ation systems across all domains of life. DNA Repair (Amst). 2014;23:4-16. doi:10.1016/j.dnarep.2014.05.003
2. Chambon P, Weill JD, Mandel P. Nicotinamide mononucleotide activation of a new DNA-dependent polyadenylic acid synthesizing nuclear enzyme. Biochem Biophys Res Commun. 1963;11:39-43. doi:10.1016/0006-291x(63)90024-x
3. Rouleau-Turcotte É, Pascal JM. ADP-ribose contributions to genome stability and PARP enzyme trapping on sites of DNA damage; paradigm shifts for a coming-of-age modification. J Biol Chem. 2023;299(12):105397. doi:10.1016/j.jbc.2023.105397
4. Palavalli Parsons LH, Challa S, Gibson BA 等人 Identification of PARP-7 substrates reveals a role for MARylation in microtubule control in ovarian cancer cells. Elife. 2021;10:e60481. Published 2021 Jan 21. doi:10.7554/eLife.60481
5. Fehr AR, Singh SA, Kerr CM, Mukai S, Higashi H, Aikawa M. The impact of PARPs and ADP-ribosylation on inflammation and host-pathogen interactions. Genes Dev. 2020;34(5-6):341-359. doi:10.1101/gad.334425.119
6. Kim DS, Challa S, Jones A, Kraus WL. PARPs and ADP-ribosylation in RNA biology: from RNA expression and processing to protein translation and proteostasis. Genes Dev. 2020;34(5-6):302-320. doi:10.1101/gad.334433.119
7. Zhang S, Lin Y, Kim YS, Hande MP, Liu ZG, Shen HM. c-Jun N-terminal kinase mediates hydrogen peroxide-induced cell death via sustained poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation. Cell Death Differ. 2007;14(5):1001-1010. doi:10.1038/sj.cdd.4402088
8. Slade D, Dunstan MS, Barkauskaite E 等人 The structure and catalytic mechanism of a poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Nature. 2011;477(7366):616-620. Published 2011 Sep 4. doi:10.1038/nature10404
9. Slade D. PARP and PARG inhibitors in cancer treatment. Genes Dev. 2020;34(5-6):360-394. doi:10.1101/gad.334516.11