流式细胞术抗体染色指南

开始进行流式细胞术或开始从仅操作活细胞转到固定和透化实验步骤，可能是一项艰巨但有益的任务。 您不仅可以洞悉表面蛋白表达差异，还可以洞悉胞内蛋白表达、磷酸化状态等。综合这些类型的读出结果可以一次性独特理解细胞群及其信号转导特征。鉴于广泛类型的实验步骤可用，我们编制了流式细胞术抗体染色指南，供全球研究人员下载，以有助抗体染色过程揭秘及一步一步指导您遍历分析设置。 使用在抗体染色指南和这份博文内的决策树步骤，我们旨在解决您可能遇到的一些常见问题。

我如何为流式细胞术实验着染表面蛋白？

我们首先从步入以下一个场景开始，在这个场景中，您有兴趣用一对表面蛋白 CD4 和 TCRβ 着染小鼠脾细胞。查看 Cell Signaling Technology^® （CST^®） 网站，祝您好运！ 这些是针对每个靶标可提供的抗体偶联物，有小鼠反应性，经流式细胞术验证过： CD4和TCRβ。虽然您知道每种蛋白质都存在于质膜上，但您需要核实抗体是否识别每种蛋白质的胞外或胞内部分。

图 1：使用流式细胞术抗体染色指南（用红线和圆圈表示），确定 CD4 (RM4-5) 示例和 TCRβ (H57-597) 示例的适当染色实验步骤路径。

每种 CST^®抗体的产品网页都包含一个来源/纯化章节，您可以在其中找到关于抗原的基本信息。这个章节可能列出蛋白质的 N 端或 C 端部分或中心氨基酸，或者该页面可能只是提到抗体可检测胞外或胞内结构域内部的表位。如果您不那么确定，请 联系技术支持 以了解更多信息。

参考产品页面，靶向 CD4 的 RM4-5 克隆和靶向 TCRβ 的 H57-597 克隆均检测其相应靶标的胞外结构域。这意味着您可以同时使用两种抗体着染活细胞。由于您在同一个实验中复用两种抗体，因此您需要选择具有不同激发/发射曲线的荧光团，以避免或尽量减少补偿需求。您决定选择 APC 和 FITC。以下是综合所有这些并且用 CD4 (RM4-5) Rat mAb (APC Conjugate) 和 TCRβ (H57-597) Hamster mAb (FITC Conjugate) 着染活小鼠脾细胞的结果：

图 2：使用活细胞实验步骤，对采用 Armenian Hamster Isotype Control (FITC Conjugate)（右图）或浓度匹配的 Armenian Hamster Isotype Control (FITC Conjugate)（左图）染色的 C57BL/6 脾细胞进行分析。样品用 CD4 (RM4-5) Rat mAb (APC Conjugate) 共染色

如何对同一样本的表面蛋白和细胞内蛋白染色以进行流式细胞术实验？

当然，收集细胞表面蛋白表达数据非常有用，但您可能还想要细胞内部正发生什么的信息。通常，了解表面蛋白表达谱允许您鉴定样品中存在的细胞类型，与此同时，检查胞内蛋白和翻译后修饰可以洞悉细胞正如何运作。在这个场景中，您对 T 细胞的 Tox/Tox2 表达感兴趣（您可以在外周血单个核细胞 (PBMC) 群中依据 CD3 表达鉴定 T 细胞）。由于您正在探测某种胞内蛋白 (Tox/Tox2)，因此您知道将需要固定和透化。

与其自我委身实验室投入额外时间依次对样品染色，不如首先通过查阅 CST^®实验步骤兼容性表来核查 CD3 共染色剂是否可用于固定和透化的细胞。

人反应性 CD3 克隆 UCHT1 识别胞外表位，在 CST ^®通常建议的所有固定和透化实验步骤中均表现良好。 这意味着，在固定和透化后，您将能够通过同时用抗 CD3（UCHT1） 和抗 Tox/Tox2 （E6G5O）抗体对PBMC染色，节省一些时间。若要固定和透化，可以使用推荐用于 Tox/Tox2 抗体的 4% 甲醛固定和 90% 冰冷甲醇透化实验步骤。 这些试剂均可单独提供，或在Intracellular Flow Cytometry Kit （Methanol）#13593中中提供。

图 3：使用流式细胞术抗体染色指南（以红线和圆圈表示），为 CD3 （UCHT1） 和 Tox/Tox2 （E6G5O） 示例确定适当的染色实验步骤l路径。

以下是样品看起来像什么样子 - 您有分属四个象限的不同 PBMC 群体：

图 4：使用 Tox/Tox2 (E6G5O) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)（右图）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)， 对淋巴细胞群上设门的固定和透化的人 PBMC 进行分析。样品用 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (APC Conjugate) 共染色。

当表面蛋白和胞内蛋白不能同时着染时优化染色

很遗憾，存在将不能用您的所有抗体对样品同时染色的情况。下一个示例中，您想要确定表达转录因子 BATF3 的 CD11c 阳性 PBMC 的比例。像以前一样，您对胞内靶标和膜靶标感兴趣。

这一次，实验步骤兼容性表显示，人反应性CD11c （3.9） 克隆对活细胞表现良好，但对已经用 FoxP3/转录因子方案以外的任何方案固定和透化的细胞表现不佳。您还有另一个考虑因素：没有直接偶联物可用于您已选择的BATF3 （E3K5H） 克隆。幸运的是，您只使用一种共染剂 （CD11c），它在不同于 BATF3 抗体（兔）的动物（小鼠）中产生，因此您将能够使用抗兔二抗来检测 BATF3。

由于 BATF3 抗体产品页面建议使用甲醛固定，随后进行甲醇透化，因此您计划首先用 CD11c 抗体对活 PBMC 染色，然后遵循对 BATF3 推荐的实验步骤操作。

图 5：使用流式细胞术抗体染色指南（以红线和圆圈表示），确定 CD11c （3.9） 和 BATF3 （E3K5H） 示例的适当染色实验步骤路径。

查看决策树中的标注，您了解到甲醇是一种可以使蛋白质荧光团变性的有机溶剂，因此您确保选择一种与小分子荧光团（在这种情况下，FITC 是）偶联的 CD11c 抗体，这种小分子荧光团在历经甲醇通透步骤携载时保留其荧光。用CD11c FITC偶联物 标记样品后，您固定并透化样品，用BATF3 抗体 对样品染色，然后用抗兔 Alexa Fluor^® 647 偶联的二抗染色。一旦您已经处理完样本并分析数据，结果是两种读出结果的阳性群体和阴性群体明确分离：

图 6：固定前用 CD11c (3.9) Mouse mAb (FITC Conjugate）共染色，使用 BATF3 (E3K5H) Rabbit mAb（右图）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control（左图)，对固定和透化的人外周血单核细胞进行分析。使用抗兔 IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) 作为二抗。

在本文所述的场景中，我们参考了流式细胞术抗体染色指南和实验步骤兼容性表，以指导其中样品用两种抗体染色的情况，但您也可以使用这些资源指导您在使用三种或更多种读数结果进行多重分析时做决定。无论您是对活细胞、固定的细胞和透化的细胞染色，还是对两者的组合染色，请务必考虑流式细胞术一般注意事项，例如纳入适当的对照和最大限度减少荧光团的光谱重叠。 最后，如果您需要额外的荧光团灵活性，请考虑询问 CST^® 定制抗体偶联服务。祝您实验成功！