表征帕金森病中的自噬-溶酶体通路

我们很荣幸与 Michael J. Fox 帕金森病研究基金会 (MJFF) 合作，推进 PD 研究。详细了解有关合作伙伴关系的信息，并探索 PD 科学资源。

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受帕金森病影响的人数正在增加，预计到 2030 年，50 岁以上的人中将有 800 多万人患有帕金森病 (PD)。¹ 该疾病的特点是由于多种细胞通路的损伤，中脑多巴胺能神经元逐渐丧失，目前尚无治愈方法。开发有效的帕金森病疗法需要高质量的抗体来研究神经退行性病变的潜在机制。

富含亮氨酸的重复激酶 2 (LRRK2) 基因是帕金森病最常见的遗传原因，人们认为 LRRK2 的突变通过影响神经元中自噬-溶酶体通路 (ALP) 的动力学而导致疾病进展。² 患者源性诱导多能干细胞 (iPSC) 是研究 LRRK2 突变影响和产生新抗体试剂的有力工具。

下载帕金森病信号转导通路

在 FUJIFILM Cellular Dynamics 的支持下，我和我的同事开发了一系列针对细胞器和中枢神经系统 (CNS) 标记物的兔和小鼠单克隆抗体，以帮助评估帕金森病的细胞过程。我们的抗体验证策略包括使用高通量成像来定量 iPSC 衍生的多巴胺能神经元 (iCell^® DopaNeurons) 中的内体和溶酶体蛋白表达，这些神经元产生于：

• 看似健康的正常供体
• 携带 LRRK2 G2019S 突变的帕金森病确诊供体
• 具有突变校正 LRRK2 的帕金森病确诊供体

请继续阅读，了解更多关于我们如何在这些体外模型中验证 ALP 相关蛋白特异性标记的抗体。在本文的末尾，您还会找到我们针对细胞器和 CNS 标记物开发的兔和小鼠单克隆抗体列表。

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iPSC 衍生的多巴胺能神经元的鉴定

在 Cell Signaling Technology (CST)，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，以确保我们的抗体具有高度特异性，并在其预期应用中发挥预期的作用。通过精心裁量与这六种补充性验证策略对应的每种目标抗体，我们保证我们的抗体适合基于适当测试模型的可用性和靶标的生物学作用等因素的用途。

在开发用于帕金森病研究的抗体组合时，我们与 FUJIFILM Cellular Dynamics 合作，利用其人类 iPSC 衍生的多巴胺能神经元 (iCell^® DopaNeurons：看似健康的正常供体 - #R1032、LRRK2 G2019S - #R1234、LRRK2 G2019S/G 突变校正对照 - #R1243）进行验证。由于这些神经元在市场上可买到并且在解冻后完全分化，因此它们可以快速生成生物学相关且可重复的结果。

iPSC 衍生的多巴胺能神经元按照 iCell DopaNeurons 用户指南进行培养。培养 14 天后，将细胞固定在甲醇中，并利用甲醛固定的免疫荧光法实验步骤或用于需要甲醇固定的基于细胞测定的免疫荧光实验步骤对各种细胞标记物和 CNS 细胞类型进行染色。使用 Operetta CLS HCA 系统在共焦模式下以 63X 捕获图像，然后使用 Harmony 高内涵分析软件、Mitochondria Analyzer for ImageJ³ 和 CellProfiler 进行定量。⁴

图 1 显示了使用针对神经元核 (NeuN)、酪氨酸羟化酶 (TH)、β3-微管蛋白和 Forkhead box 蛋白 A2 (FoxA2) 的 CST 抗体对对照和 LRRK2 G2019S iPSC 衍生的多巴胺能神经元进行的代表性免疫荧光染色，从而证实了神经元的多巴胺能性质。

图 1：iCell^® DopaNeurons 的鉴定。使用 NeuN (E4M5P) Mouse mAb #94403 和 Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit mAb #58844（上图）或 β3-Tubulin (E9F3E) Mouse mAb #45058 和 FoxA2/HNF3β (D56D6) XP^® Rabbit mAb #8186（下图）对供体来源的多巴胺能健康 WT 神经元和携带 LRRK2 G2019S 突变的细胞进行染色。

对具有 LRRK2 突变的 iCell^® DopaNeurons 中的溶酶体进行评估 

通过对所有三种类型 iPSC 衍生的多巴胺能神经元中的溶酶体相关膜蛋白 1 (LAMP1) 和组织蛋白酶 B (CTSB) 进行染色并使用 β3-微管蛋白和 DAPI 进行复染，以评估溶酶体。然后对平均荧光强度 (MFI)、每个神经元的斑点和斑点面积进行定量分析，如图 2 所示。 

图 2：在 iCell^® DopaNeurons 中成像的溶酶体蛋白。在健康对照 iCell^® DopaNeurons 中对溶酶体蛋白 LAMP1 (D2D11) XP^® Rabbit mAb #9091 (A) 和 Cathepsin B (D1C7Y) XP^® Rabbit mAb #31718 (E) 进行成像，这些神经元携带 LRRK2 G2019S 突变和 LRRK2 突变校正对照 (MCC) 神经元。对图像的平均荧光强度 (B, F)、每个神经元的斑点 (C, G) 和斑点面积 (D, H) 进行定量分析。

与健康对照和突变校正神经元相比，LRRK2 G2019S 神经元中 LAMP1 和组织蛋白酶 B 的 MFI 呈较低趋势，这在意料之中，因为溶酶体缺陷是 PD 的一个特征。当我们通过分别定量每个神经元的 LAMP1+ 斑点和斑点面积来观察溶酶体的数量和大小时，没有观察到基因型之间的差异。

具有 LRRK2 G2019S 突变的神经元显示 LC3 信号增强

使用 LC3A/B (D3U4C) XP^® Rabbit mAb #12741，通过轻链 3 (LC3) 染色比较三种不同细胞类型的自噬情况。图 3 显示 LRRK2 G2019S 神经元中的 LC3 增加，并在 LRRK2 突变校正对照 (MCC) 细胞中恢复至正常水平。

图 3：LC3 染色的定量。使用 LC3A/B (D3U4C) XP^® Rabbit mAb #12741 (A) 对 iCell^® DopaNeurons 进行染色 (A)，并对平均荧光强度进行定量 (B)。

LRRK2 G2019S 不改变线粒体形态

为了确定线粒体数量和总体形态是否受到 LRRK2 G2019S 突变的影响，对健康和 LRRK2 G2019S 神经元进行细胞色素 c 氧化酶 IV (COX IV)（一种广泛使用的线粒体标记蛋白）染色。两种细胞类型之间没有观察到显著差异，如图 4 所示。

图 4：iPSC 衍生神经元的线粒体形态评估。使用 COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850(A) 对 iCell^® DopaNeurons 进行染色，并应用阈值 (B) 来量化线粒体参数。每个神经元的线粒体数量 (C)、每个线粒体的分支数量 (D) 和每个神经元的分支连接数量 (E) 没有发现变化。

帕金森病研究的未来

由于目前尚无治愈帕金森病的方法，研究人员需要高质量的抗体来加深对这种普遍的神经退行性疾病的了解。我们开发了一系列针对细胞器和 CNS 标记物的兔和小鼠单克隆抗体，可帮助评估帕金森病的细胞过程，并使用市售的人 iPSC 衍生的多巴胺能神经元来支持我们严格的验证过程。 

我们的数据表明，携带 LRRK2 G2019S 突变的帕金森病供体来源的多巴胺能神经元表现出 LC3 表达升高，这种情况在校正 LRRK2 突变的神经元中得到解决，并且 LRRK2 G2019S 突变对溶酶体和线粒体的数量和总体形态没有影响。

我们会继续开发更多抗体以推进帕金森病研究，并定制我们的验证策略以确保高特异性和可靠的性能。

针对细胞器和 CNS 标记物的单克隆抗体

• NeuN (E4M5P) Mouse mAb #94403

• Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit mAb #58844

• β3-Tubulin (E9F3E) Mouse mAb #45058

• FoxA2/HNF3β (D56D6) XP^® Rabbit mAb #8186

• LAMP1 (D2D11) XP^® Rabbit mAb #9091

• LC3A/B (D3U4C) XP^® Rabbit mAb #12741

• Cathepsin B (D1C7Y) XP^® Rabbit mAb #31718

• COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850

   

选择参考文献：

1. Dorsey ER, Constantinescu R, Thompson JP, et al. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations, 2005 through 2030. Neurology. 2007;68(5):384-386
2. Madureira M, Connor-Robson N, Wade-Martins R. "LRRK2: Autophagy and Lysosomal Activity". Front Neurosci. 2020 May 25;14:498. doi: 10.3389/fnins.2020.00498. PMID: 32523507; PMCID: PMC7262160.
3. Chaudhry A, Shi R, Luciani DS. A pipeline for multidimensional confocal analysis of mitochondrial morphology, function, and dynamics in pancreatic β-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2020;318(2):E87-E101. doi:10.1152/ajpendo.00457.2019
4. Stirling DR, Swain-Bowden MJ, Lucas AM, Carpenter AE, Cimini BA, Goodman A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 2021;22(1):433. Published 2021 Sep 10. doi:10.1186/s12859-021-04344-9
   

科学营销作家兼 CST 博客管理员 Alexandra Foley 对本文的撰写做出了贡献。24-NDT-69935