如果您可以在单个细胞中测量 RNA、识别细胞类型并检测细胞内信号转导，情况会怎样？从理论上讲，这种检测将成为信号转导研究领域的罗塞塔石碑，有望改变我们对疾病进展和治疗反应的理解。这个全面的数据集将使我们能够直接测量细胞类型如何影响 RNA 水平和蛋白质表达，反之亦然，从而能够更深入地了解患病组织和健康组织之间的差异。
多年来，科学家一直致力于开发这种检测方法，但在不降解 RNA 的同时，准确衡量细胞内数据及其翻译后修饰 (PTM) 始终是一大难题。尽管一些新方法已经取得了进展，但在不同领域、实验室和应用中的可重复性仍然存在问题。
现在，一种全新的方法利用最前沿的 10x Genomics Chromium 基因表达技术，结合 Feature Barcode 和 CST 严格验证的抗体，有望实现这一目标：InTraSeq™ 单细胞分析检测。
图 1. 左图：大多数单细胞分析技术检测 RNA，并使用条形码抗体测量表面蛋白以进行表型分析。中图：许多用于检测细胞内蛋白的方法都存在严重的 RNA 丢失和降解问题。右图：InTraSeq 检测法可检测 RNA 以及细胞内和表面蛋白，同时保留 RNA。
“InTraSeq 是一种技术，实际上我们可以在单细胞水平上观察细胞内的信号转导成分，并将其与 scRNA-seq 相结合，”哈佛医学院神经学系 Samuel L. Wasserstrom 教授、布莱根妇女医院资深科学家、兽医学博士 Vijay Kuchroo 博士解释道：“这实际上将是一项革命性的技术。”
但是为什么在单个样本中同时捕获单细胞 RNA 和细胞内信号转导数据如此具有挑战性？为了理解这一突破，首先需要了解研究人员在结合转录组学和蛋白质组学信息时所面临的挑战。
开发可重复的多组学和多模态 scRNAseq 检测方法
在过去，细胞信号转导研究通常在细胞群体层面进行——研究人员将细胞研磨，并使用蛋白质印迹法或免疫沉淀法等技术来分析 PTM。然而，这种方法只能呈现整个细胞群体的信号转导活性概况。
“我们从单细胞 RNA 测序中了解到，异质样本中单个细胞的功能截然不同，”密切参与 InTraSeq 技术开发的 CST 资深科学家 Majd Ariss 解释道：“这种差异在疾病组织中特别重要，尤其是在复杂的肿瘤及其微环境中，不同的细胞类型根据其空间位置表现出不同的生物过程。”
到目前为止，主要的挑战是能够同时从 scRNA-seq 实验中获取转录组学数据，以及从识别细胞内 PTM 和/或细胞质蛋白的分析中获得细胞类型的功能指标。虽然有多种方法可以单独实现其中一项或两项分析，但没有任何方法能在单个样本中同时进行这些分析，因此只能提供细胞生物学的部分视图。
“RNA 很容易降解，大多数试图检测细胞内蛋白质的方法最终都会破坏 RNA，”Ariss 解释道：“这使得从同一细胞获取转录组学和蛋白质组学信息变得极其困难。”
此外，信号转导事件与转录变化的时间尺度存在显著差异。如何弥合这一时间差，以揭示快速信号转导事件如何引发长期转录变化，一直是研究中的重要挑战（图 2）。
图 2.信号转导事件发生在几分钟到几小时内，而 RNA 转录和蛋白质的翻译则需要大约 1 小时到几天的时间。
“信号转导通常发生在几分钟到一个小时内，而转录过程则需要几天——通常是几小时到几天不等，”Kuchroo 解释道：“因此，如何将短短 10 分钟内发生的信号转导事件与其在数天后对转录和细胞功能的影响关联起来，实际上是一个亟待解决的有趣且复杂的问题。”我认为 InTraSeq 将解决这个问题。”
Ariss 和 CST 的团队与 Kuchroo 博士以及其他领先的研究人员合作，开发出能够准确协调信号转导、转录和翻译的不同时间尺度的计算方法。
“我们与 CST 的 Majd 密切合作，集思广益，想出解决办法，并了解如何使用这些工具来解决问题，”Kuchroo 说道：“这不仅涉及运行一些 InTraSeq 抗体和组分，还包括如何在计算上[将来自不同时间尺度的数据]结合起来。”
最终的成果是 InTraSeq 技术，这是一种多模态 scRNA-seq 检测，利用寡核苷酸条形码抗体，使用相对简单的实验步骤从单个样本中进行 RNA 和蛋白质分析（包括细胞内 PTM）。这一突破性技术使研究人员能够直接将信号转导事件与单个细胞内的转录输出直接联系起来，从而提供对细胞异质性和功能的更深入理解。
图 3. 使用 InTraSeq 细胞内和信号转导通路抗体分析分离的 CD4+ 和 CD8+ 细胞，以识别仅使用 RNA-seq 难以研究的细胞状态。InTraSeq 检测提供了对细胞亚群的无与伦比的洞察，从而可以更深入地了解疾病机制。
“现在，从计算角度来看，我们不仅仅是在分析传递信号的分子，还在构建细胞内部的信号网络，接着观察……信号转导通路在转录层面上实际上诱导了什么，”Kuchroo 解释道。
桥接 RNA 和蛋白质数据所带来的见解
人们长期以来一直认为 RNA 的存在与蛋白质合成相关，并且 mRNA 的丰度可用作推断蛋白质水平的指标。然而，InTraSeq 技术等多模态 scRNA-seq 检测表明，情况并非总是如此。RNA 降解以及转录和翻译之间的时间差异，可能导致传统检测方法中数据的不一致。
“凭借 InTraSeq 技术，我们发现 RNA 水平可能与蛋白质表达之间存在差异，”Ariss 解释道：“这项早期研究强调了在同一细胞中研究这些过程的重要性，以充分了解信号转导通路如何影响转录并最终影响细胞功能。”
Ariss 研究发表在预印本论文《InTraSeq：揭示新的单细胞生物学和调节机制的多模态分析》中，该研究由布莱根妇女医院 Gene Lay 免疫学和炎症研究所、麻省总医院和哈佛医学院的 Kuchroo 博士等科学家合作完成。
InTraSeq 检测方法通过弥合 RNA 转录与蛋白质活性之间的差距，提供了对细胞生物学更细致入微的理解。这一技术有望揭示此前未被发现的细胞状态和机制，从而加深我们对疾病进展及治疗反应的理解。
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