CST 博客: 实验室展望

Cell Signaling Technology (CST) 官方博客,我们在这里讨论您在实验台前工作时的期望,分享贴士、技巧和信息。

CRISPR:2015 年《科学》杂志年度突破

阅读更多内容
所有帖子

作为一种精巧的基因编辑工具,CRISPR 已然席卷科学界。它有一个引人注目的名字,几乎在每一个出版物中都会提到它,而且是涉及知识产权索赔的激烈法律纠纷的主题,1 它的使用引发了与其伦理影响有关的无数次会议,尽管它问世还不到 4 年,《科学》杂志还是将其评为“年度突破”。2 为了更好地理解 CRISPR,来看看其他领域中可与其重要意义相提并论的事件,比如成功掠过冥王星这颗遥远矮行星的“新地平线号”探测器、在大脑中发现淋巴系统以及埃博拉疫苗的问世。 

好了,您已经明白 CRISPR 非常重要,但它究竟是什么?科学家们又为何对其如此痴迷?

CRISPR 定义

成簇的规律间隔短回文重复序列(或 CRISPR)是原生于原核生物基因组的重复 DNA 序列(同向重复序列)。它们之间有“间隔区” 即可证明过去发生的侵入的病毒源性独特 DNA 序列。一旦遭受病毒再次侵犯,细菌就可以转录相关的间隔区以产生单链非编码性“向导”RNA,这类 RNA 可以:

  1. 与入侵者独有的间隔序列发生沃森-克里克碱基配对,并且
  2. 召集 CRISPR 元件上游基因编码的 CRISPR 相关 (Cas) 核酸内切酶。

Cas 核酸内切酶可切割外来病毒 DNA,从而扰乱病毒复制。因此,CRISPR 是赋予入侵性基因元件抵抗性的免疫记忆形式。从免疫学家的角度来看,这本身就是一个令人震惊的发现,几年前或许偶然间发现。3,4 现在已知绝大多数细菌在其基因组中携有 CRISPR。仅几年前才揭示,CRISPR/Cas9 系统有模块性并且我们可以将其工程化以充当用相对微小的付出操纵任何目的基因组的基因编辑工具。5,6

CRISPR 作为一种研究工具

在细菌中,Cas9 天然地联合由 crRNA (CRISPR RNA) 和 tracrRNA(反式激活性 crRNA)组成的双指导 RNA 一起发挥作用。crRNA 的 5’ 末端与靶标 DNA 发生碱基配对,而其 3’ 末端与 tracrRNA 形成一个双链茎环结构,以促进 Cas9 召集。现已证实嵌合性单指导 RNA或合并两个序列的 sgRNA 成功支持 Cas 内切酶的功能。7 因此,通过设计与目的基因有序列互补性的 sgRNA,研究人员可以对 Cas 酶l类、最常见 Cas9(称为 Cas II 系统))编程,以在任何给定物种的基因组内部所需基因座处切割 DNA。

虽然 sgRNA 有助 Cas9 找到目的序列,但是 Cas9 与该序列的结合需要一个邻近的三核苷酸原间隔序列邻近基序(PAM) 存在,该基序充当 Cas9 在其上附着的分子把手。因切割事件产生的平端 DNA 双链断口 (DSB) 触发 DNA 修复反应,称为非同源末端连接 (NHEJ)。由于其易错性质,NHEJ 在切割位点引入插入或缺失(插入缺失),从而造成扰乱基因表达。此外,当伴有模板 DNA 和具有 DNA 切口酶活性而非核酸酶活性的 Cas9 突变形式时,这个系统可用于使 DNA 修复装置偏向高保真同源性定向修复 (HDR) 机制,创建基因插入。因此,可以如此标记某些基因组区域,从而基因可以在体内可视化,而且可以恢复损害功能性蛋白质表达的突变基因区域,从而缓解诸如肌肉萎缩症等病症。8,9

值得注意的是,通过引入多种指导引 RNA 和单链 DNA 寡核酸(可充当引入精确碱基替换(突变)的模板),可以在体内(通常在小鼠中)协调多个基因缺失和插入。10 这使得研究多基因现象(例如肿瘤发生中突变组合的作用)成为可能。 

历史上,旨在产生敲入或敲除小鼠的体内基因打靶工作既极度费力,又十分耗时,而现在 CRISPR 使这项工作看似“公园漫步”。

CRISPR 的创新性应用

这只是借助 CRISPR/Cas9 可能实现和已实现的无数目标中的一小部分。其他创新性应用是:去除猪基因组的逆转录病毒元件,因此将猪器官异种移植入人体可以是一个安全可行选择;11庞大的全基因组筛选以鉴定引起化疗药物耐药性的基因,12以及在人多精受精卵(体外受精的无活力副产物)中应用这个系统,尝试纠正会引起遗传性血液疾病的基因缺陷。13

后一项由黄军就领导的研究有助揭示 CRISPR/Cas9 系统的缺陷,包括脱靶效应以及选择 DNA 修复机制(NHEJ 或 HDR)以修补切割位点的方式变化无常且不可预测。13 这项研究于 2015 年 5 月发表,在科学界内部引起重大伦理顾虑。事实上,在全球一直存在关于这项技术伦理意义的讨论,CRISPR 领域的开拓者 Jennifer Doudna 呼吁召开一次国际峰会吸引人们关注这个主题。14顺便说一句,黄军就名列《自然》2015 年“年度十大人物”榜单;被称作“胚胎编辑人”。

CRISPR 与 RNAi

如果您认为 sgRNA 与沉默 RNA (siRNA) 之间有相似之处,这是情有可原的,它是可介导基因表达翻译后下调的短单链 RNA。这种内源性机制已被广泛采用并依赖 Argonaute 蛋白家族实现 mRNA 降解以及后续的基因产物“敲减”。其中区别在于:在 siRNA 在 mRNA 层面调节基因表达的同时,CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合体在基因组层面发挥作用,驱动基因“缺失”。因此,CRISPR/Cas9 是一种基因编辑工具,类似于 TALEN(转录激活因子样效应子核酸酶)和设计物锌指 (ZNF) 核酸酶。

相比之下,CRISPR 系统更具吸引力,因为它易于工程化、可扩展且价格合理。其借助诸如 Addgene 等开源非盈利发布者的可获得性有助于推动顺利采用这项技术。 

这项技术的另一个引人注目特性是,连同 Cas9 mRNA 一起单纯引入不同的导引 RNA 就可能进行多重基因编辑。15,16

如需了解有关使用 TALEN、ZNF 和 CRISPR/Cas9 进行基因编辑的利弊的详细信息,Jackson Laboratory 的一篇深度博文值得一看。

结论

总之,CRISPR 技术的开拓者认为它与诸如 PCR 等通用工具平分秋色。在促进科学进步方面,它大概能够像基因组测序一样具有革命性。最终,研究人员欣然接受这种技术也就不足为奇了。如果您也是其中之一,也许您会发现自己也需要 CST 的 Cas9 抗体

祝您编辑愉快!

选择以下参考文献

  1. Ledford H (2016) Bitter fight over CRISPR patent heats up. Nature 529(7586), 265.
  2. Travis J (2015) Making the cut. Science 350(6267), 1456–7.
  3. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (2005) Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60(2), 174–82.
  4. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315(5819), 1709–12.
  5. Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157(6), 1262–78.
  6. Sternberg SH, Doudna JA (2015) Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9. Mol. Cell 58(4), 568–74.
  7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096), 816–21.
  8. Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, Chew WL, Widrick JJ, Yan WX, Maesner C, Wu EY, Xiao R, Ran FA, Cong L, Zhang F, Vandenberghe LH, Church GM, Wagers AJ (2016) In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science 351(6271), 407–11.
  9. Dow LE, Fisher J, O'Rourke KP, Muley A, Kastenhuber ER, Livshits G, Tschaharganeh DF, Socci ND, Lowe SW (2015) Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 33(4), 390–4.
  10. Yang L, Güell M, Niu D, George H, Lesha E, Grishin D, Aach J, Shrock E, Xu W, Poci J, Cortazio R, Wilkinson RA, Fishman JA, Church G (2015) Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science 350(6264), 1101–4.
  11. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F (2015) Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517(7536), 583–8.
  12. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, Lv J, Xie X, Chen Y, Li Y, Sun Y, Bai Y, Songyang Z, Ma W, Zhou C, Huang J (2015) CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 6(5), 363–72.
  13. Doudna J (2015) Genome-editing revolution: My whirlwind year with CRISPR. Nature 528(7583), 469–71.
  14. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013) One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153(4), 910–8.
  15. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas O, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F (2014) CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell 159(2), 440–55.

最新文章

获得准确流式细胞术数据的细胞制备技巧

生成准确的流式细胞术数据不仅需要……
Andrea Tu, PhD 2024 年 11 月 6 日

500 抗体和计数:利用经过 Simple Western 技术验证的 CST 抗体加速发现

自 2022 年以来,Cell Signaling Technology (CST) 和 Bio-Techne 一直携手合作,将一流的……
Chris LaBreck, PhD 2024 年 10 月 23 日

Menin-KMT2A 抑制剂:一种有前景的急性髓性白血病 (AML) 治疗方法

造成约 80%的成人急性白血病,急性髓性白血病 (AML) 是一种侵袭形式的……
Homa Rahnamoun, PhD 2024 年 10 月 16 日
Powered by Translations.com GlobalLink Web SoftwarePowered by GlobalLink Web