真正的创新来自合作 – 来自专家们汇聚一堂，创造出全新方式解决挑战的技术和工具。空间生物学革命是工具和英才结合如何带来进步的一个例证。空间生物学， 2020 年《自然》杂志确定的本年度方法，融合出诸项技术的组合，包括“来自微阵列、成像、测序和生物信息学分析的构思和技术”，以提供组织中细胞的数据和位置背景。一个快速演进的领域、新工具、技术和方法持续被开发，从而加速空间蛋白质组学研究。
正是这个原因，我们才非常高兴与 Leica Microsystems (LMS) 合作，验证用于 Cell DIVE 多重分析成像解决方案的抗体。通过协作，我们正将 CST 抗体专家和 LMS 成像专家汇聚一堂，通过消除研究过程中一个最耗时、成本与人力投入最密集的部分，帮助科学家们加速空间生物学研究：抗体组合验证。
历经过去数月，作为这种合作伙伴关系的一部分，我们的抗体偶联团队小组负责人 Reggie Prioli 博士以及 CST 科学家 Emily Alonzo 博士和 Lisa Arvidson 与 LMS 科学家 Melinda Hill 博士合作，鉴定并验证了 30 种对肿瘤学研究至关重要的抗体，这些抗体将加入75 种已经由 LMS 验证用于 Cell DIVE 的 CST 抗体。
这篇帖文深入介绍了合作伙伴关系、团队的抗体选择与验证过程和后续事宜。
在 Cell DIVE 上的空间生物学研究：复用 60 多种生物标记物
强有力的新型成像和计算工具如Cell DIVE 使得在正常细胞和病态细胞的空间环境下探索这些细胞成为可能。这总是有助进一步阐明疾病的生物学基础并回答诸如为何一名患者可能对治疗有积极反应，而另一名患者却没有积极反应等重要问题。
“[然而]，传统的组织成像方法是一个迭代性系列过程，”LMS 的 Cell DIVE 销售专家 Rick Heil-Chapdelaine 解释说，“要获得更多标记物，您必须使用来自一份样品的多张组织切片。由您在每张切片中取得到不同的细胞，故您最终所得是了解细胞邻域，而非了解这个邻域内部的各个细胞。”
另一方面，Cell DIVE 可以使用一种迭代技术在单个组织样本中多重分析 60 多种生物标记物，这种迭代技术包括生物标记物染色、样本成像及化学染料温和失活过程。从本质上讲，如果您将抗体和相关的荧光团想象成灯泡，染料失活过程允许研究人员在成像后关灯，但把灯泡留在原地。可以添加、成像和关闭额外的灯泡，而不负面影响组织样本（图 1）。
图 1：Cell DIVE 迭代多重分析过程。图片由 Leica Microsystems 友情提供。
“Cell DIVE 让我们做的就是采集单份样本并历经一个迭代过程：染色，随后染料失活；染色，随后染料失活，以产生高清图像，这些图像拼合在一起供下游统计分析，”Rick 解释道。这个过程在图 2 展示。
图 2：Cell DIVE 多重分析成像解决方案可以使用 60 多种生物标记物产生完整组织的高清图像，同时自动校准和修正以实现稳健的下游分析。上图显示了六轮成像，每轮采用四个生物标记物（中图），以及显示 24 种生物标志物的已拼合最终图像（右图）。图片由 Leica Microsystems 友情提供。
Cell DIVE 的最独特方面之一是，切片可以在成像后储存起来，而数月或甚至数年后对额外的生物标记物再染色。
“您可以储存您的切片，并在您的假设演变或发布新型生物标记物靶标时，翻出这些切片以进一步研究同一组织样品，”Melinda 解释说，“不是对您已经测试过的所有生物标记物再染色，而是您可以用额外的生物标记物覆盖原始切片，以在原始环境下探测更多数据。这可以帮助加快发现，并且省时省钱。”
然而，尽管 Cell DIVE 在抗体选择和定制抗体组合设计方面提供灵活性，但该设备上使用的抗体除其特异性和灵敏度外，还需要验证和确认仪器兼容性。
“抗体确实是整个 Cell DIVE 方法的核心，”Rick 说，“拥有特异性和灵敏度足以在 Cell DIVE 系统上发挥作用的优质抗体，这是进行可信赖下游分析的关键所在。”
您可以信赖的多重分析：针对 Cell DIVE 的抗体选择和验证
科学界存在持续的可重复性危机意味着研究人员在选择和验证其实验所用抗体时必须格外小心。LMS 已经测试了大约 2,000 种市售抗体，但只有大约 350 种经验证可用于 Cell DIVE 系统上。这意味着大约三分之二的抗体因灵敏度、特异性或这两者而失败。此外，仅大约 10% 已验证的抗体作为商业偶联物可从制造商获得，这意味着研究人员不得不亲自偶联，以便在 Cell DIVE 上使用这些抗体。
“验证数目如此之低的原因是因为大多数来自供应商的抗体可能质量上高度参差不齐，”Melinda 解释说，“这就是为什么高质量抗体必不可少的原因，也是我们对此次正在进行的合作如此兴奋的原因。CST 是高质量已验证抗体的引领者，我们发现，只要 CST 抗体经验证在 IHC 和 FFPE 中有效，那么我们总是可以几乎确信，这些抗体将对 Cell DIVE 有效。”
剩下的唯一变量是偶联。对于一种在 Cell DIVE 上工作的抗体，它必须能够偶联于可实现仪器迭代过程的荧光团。标记程度 (DOL) 也重要，抗体浓度也如此，为了在 Cell DIVE 成像仪上取得成功，二者均须优化。因此，拥有偶联专家创造的市售偶联物可能对实现成功成像至关重要。
那么，对于依照 Cell DIVE 多重分析成像解决方案使用，如何选择和验证 CST 抗体？
抗体选择
在 LMS 和 CST 建立合作伙伴关系之初，该团队根据抗体对空间生物学研究的有用度、对特定疾病状态的适用性以及抗体在系统中发挥作用的可能性，划分抗体优先顺序。
“在组织内部处置空间生物学时，存在您想查看的三个类型抗体标记物：一类标记物告诉我们细胞在何处，一类标记物告诉我们这些细胞是什么，并且一类标记物告诉我们这些细胞正在做什么，”Rick 解释说，“然后，您可以开始查看空间信息，比如‘我们那些正在影响特定响应的邻居怎么样了？’”
该团队的抗体初清单遵循这个一般规则，并且包括用于划分和表型分型的抗体，尤其那些用于帮助了解肿瘤微环境 (TME) 如何在肿瘤发生和治疗响应期间演变的肿瘤学标记物。优先处理用于研究髓样和淋巴样细胞谱系和结构的免疫细胞标记物，以及用于检测 TME 中关键蛋白质（例如波形蛋白、Ki-67、TIM-3 和 CD45）的标记物。还优先处理可作为 CST® 偶联物或可作为定制偶联物提供的抗体。
最终清单表包括大约 30 种 CST 抗体。
抗体验证
为了验证这些抗体，该团队检查了生物标记物跨 12 种不同人类癌组织（包括在 Cell DIVE 上成像的完整组织切片和组织微阵列 (TMA) 切片）的表达情况。验证研究着眼于肿瘤细胞谱系和免疫细胞谱系在 TME 中的表达，并捕捉它们的空间关系。
图 3：CST 抗体组合的多重成像使得在单一切片上检查结肠腺癌 (CAC) 组织中多个免疫细胞组分成为可能。
实施了十轮不同的测试，以确保染料失活后亲和力延续。将生物标记物抗体偶联并在不优化下随机分配给某个染色步骤。在每个步骤之后，将各抗体与文献比较并相互比较，然后就特异性和灵敏度接受评估。
所得的数据组使得辨识含有不同免疫类别、不同细胞类型和不同亚型细胞的聚类成为可能，并对 TME 中免疫细胞群体（连同其他细胞群体）及细胞空间相互作用提供前所未有的新颖见解。
图 4：使用 30 种生物标志物划分后的聚类分析，揭示了组织内部的免疫细胞及其与其他免疫细胞和细胞簇 (UMAP) 的关系。
“根据我们之前的验证失败率，预计有大约三分之一的抗体会失败，所以在我们最初的 35 种抗体列表中大约有 10 到 12 种抗体会失败，”Melinda 解释道，“然而，我们却发现在 35 种抗体中，有 33 种可用于 Cell DIVE，这说明了 CST 抗体和偶联物的品质优异。”
2022 年癌症免疫治疗学会 (SITC) 年会上呈献的海报展示《采集人类癌组织微环境中肿瘤细胞谱系和免疫细胞谱系的空间景观》中总结了最终项目。
由 LMS 和 CST 验证 — 您无需动手
凭借这种合作伙伴关系，CST 和 LMS 团队希望从多重成像用抗体选择中取得一些猜想，并为研究人员节省宝贵时间及减少挫败感。
“我们询问客户，当他们考虑抗体偶联过程时想到哪些词，而我们得到了一些非常有趣的回复，”Rick 总结道，“一些最常见的答案是诸如‘耗时’、‘繁杂’等等，我们因此了解到许多科学家对此并不感兴趣。”
通过将 LMS 的显微镜与成像专家与 CST 的抗体专家汇聚一堂，这种协作有助不仅向研究人员提供实施空间生物学研究的正确工具，而且还提供相信这些工具将会发挥作用的能力。这将使研究人员能够花更多时间做他们最擅长的事情 — 发现新颖方式探索疾病机制。
CST 科学家 Emily Alonzo 说：“我们很高兴能够为研究人员做一些诸如此类的工作，这样我们就可以为他们减少这些障碍。”“这将使他们更快着手实质实验，从而可以获得他们真正感兴趣的数据。”
在未来的一年，作为这种持续性合作伙伴关系的一部分，该团队将继续验证更多用于 Cell DIVE 成像仪上的抗体，因此请务必核查更新内容！
其他资源：
- 详细了解 CST 如何验证用于免疫组织化学的抗体。
- 阅读合作伙伴关系新闻稿。
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