信号太低无法检测？您的 CUT&Tag 库可能仍值得测序

您装上生物分析仪，屏住呼吸，然后看着轨迹出现。而不是一个干净的高峰，您看…… 几乎什么都没有。没有明显的库峰值，没有令人欣慰的曲线——只有一条模糊的痕迹，看起来好像失败了。与此同时，您的测序预算很紧张，样本很珍贵，而您的项目时间却在一分一秒地流逝。

对于每位表观遗传学研究人员来说，这一刻最让人焦虑：文库真的彻底失效了吗？还是即便信号微弱或几乎不可见，仍能产生高质量的 NGS 数据？在这篇文章中，我们将解释为什么“信号太低无法检测”并不等同于“质量太差不足以测序”，以及如何根据数据自信地做出决策，判断何时应该继续推进，何时应该回到实验阶段。

染色质分析方法，例如染色质免疫沉淀法 (ChIP) 和下一代测序分析，彻底改变了研究人员研究蛋白质-DNA 相互作用的方式。诸如 ChIP-Seq 这样的技术已经迅速成为生成全基因组结合图谱的标准方法。开发了 CUT&RUN 和 CUT&Tag 等新方法，以解决传统 ChIP 工作流程的关键痛点，包括输入要求、背景信号和实际操作时间。

如果您已经采用了 CUT&Tag 技术，往往希望从少量细胞中获得更高灵敏度，并获得目标靶标的更清晰信号——因此，当生物分析仪的轨迹显示“低产量”时，尤其会感到沮丧。文库准备就绪后，您将面临一个关键的决策点：如何解读 NanoDrop 或 Qubit 测量结果以及 Bioanalyzer 或 TapeStation 的轨迹，判断您的 CUT&Tag DNA 文库是否仍然值得测序。

ChIP-Seq、CUT&RUN 和现在的 CUT&Tag 都依赖于 NGS 之前的精确 DNA 定量；然而，不同的方法对同一个文库可能会产生截然不同的结果。 

Bioanalyzer 仪或 TapeStation 仪经常用于设立 DNA 和 RNA 样品质量控制。在分析之前，可使用 Thermo Fischer Scientific Nanodrop 仪、Qiagen QIAxpert 系统、Thermo Fisher Scientific Qubit 荧光计定量系统或 PicoGreen 测定法测定文库浓度。然而，已扩增 CUT&Tag DNA 文库的测量产量可能基于所用方法变动。

下面，CST 的科学家们对比了 NanoDrop、Qubit 和 PicoGreen 对同一扩增的 CUT&Tag DNA 文库的测量结果，并提供了实用的产量指导原则——以及即使这些数值看起来很低，为什么仍然可以获得高质量的 NGS 数据。

生物分析仪信号低甚至检测不到并不意味着您的 CUT&Tag 文库测序一定会失败，尤其是在更灵敏的定量方法和对照支持继续进行的情况下。

请参阅 CUT&Tag 常见问题 (FAQ) 页面，查看支持性数据和/或了解将不同产量的样品汇集在一起的指导。

Bioanalyzer 或 TapeStation 系统为您提供关于样品浓度、片段平均大小范围和样品纯度的信息。当目的靶标（例如转录因子）在细胞中含量不高，或者只有少量细胞可用时，这些分析结果可能表明文库产量较低，从而难以判断是否要继续进行 NGS 分析。

在这种情况下，许多使用 ChIP-Seq 或 CUT&RUN 文库的研究人员可能会选择放弃，但使用 CUT&Tag 时，文库的基线阈值更低——这就提出了一个重要的问题：即使来自 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统的信号低，仍可能成功对 CUT&Tag DNA 文库测序吗？

即使 Bioanalyzer 或 TapeStation 的信号低，CUT&Tag 也可能提供优质的 NGS 数据

使用低丰度靶标或少量细胞时，我们建议将阳性对照如 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) 随您的 DNA 文库一起运行来评估实验步骤成功与否。¹如果阳性对照信号高但靶标文库信号低，仍然可以成功对 CUT&Tag DNA 文库测序，以提供重要的蛋白质-DNA 相互作用数据（图 1）。 

因此，我们建议即使您在来自 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统的图谱中看到极弱峰或甚至看不到可见峰，仍对 CUT&Tag DNA 文库测序。

尽管在高灵敏度生物分析仪芯片上信号较弱，但仍获得了可靠的 TCF4/TCF7L2 测序结果