3 倍数据、3 倍洞察：使用 DIA 进行深度蛋白质组学分析

随着生物技术公司继续利用蛋白质组学分析进行关键研究，如生物标记物发现、靶向和脱靶验证以及作用机制研究，研究人员越来越频繁地询问：“我怎样才能从我珍贵的样本中获得更多见解？”

虽然蛋白质组学无疑促进了我们对疾病生物学的理解，但有时它可能无法提供解决感兴趣的生物学问题所需的深度或特异性。现在，强大的新技术使得人们能够比以前更加全面地了解情况。数据独立采集 (DIA) 蛋白质组学是一种令人兴奋的自下而上的新方法，可以提供更全面的蛋白质表达、信号转导相互作用和翻译后修饰 (PTM) 信息，从而最大限度地优化发现工作流程。

“与我们上一代仪器相比，我们在 Orbitrap Astral 平台上使用 DIA 鉴定和定量的蛋白质数量增加了 3 倍以上。”  ~ Matt Stokes，CST 蛋白质组学主任

然而，尖端仪器的高昂费用使得许多实验室无法获得这些见解。CST 的蛋白质组学分析服务团队很高兴安装了最先进的 DIA 蛋白质组学设备 - Thermo Scientific 的 Orbitrap Astral 质谱仪。根据我们的研究结果，Orbital Astral 分析仪可以提供比传统的数据依赖采集 (DDA) 蛋白质组学多三倍的数据量。

如果您希望提高分析的灵敏度、可重复性和覆盖范围，我们邀请您使用这款强大的仪器，发掘那些可能无法获得的生物学见解。

请继续阅读，了解通过 DDA 与 DIA 方法所获得结果的更详细比较，以及最先进的蛋白质组学工具如何获取传统蛋白质组学分析可能遗漏的数据。

<详细了解 CST 的蛋白质组学分析服务>

深度蛋白质组学分析：DDA 与 DIA 方法

基于质谱的自下而上的蛋白质组学已经发展成为大规模、高通量蛋白质组分析最强大的技术之一。对于基于发现或非靶向的蛋白质组学，自下而上的方法能够实时监测生物学，并可以为蛋白质丰度或加工的离散变化提供广泛的分子证据。与 PTMScan 工作流程相结合，研究人员可以研究触发疾病进展或对靶向药物治疗反应的细胞通路的调节。

如上所述，有两种主要的液相色谱-质谱 (LC-MS) 数据采集策略可用于量化给定样本中的蛋白质：数据相关采集 (DDA) 和数据非相关采集 (DIA)。

下面的类比可以帮助解释两者之间的区别： 

DDA 方法类似于使用低分辨率相机在印刷胶片上拍摄照片，而 DIA 方法则类似于捕捉超高清的数字图像。在这个类比中，DDA 获取的“图像”是像素化的，分辨率可能不足以清晰地区分照片中的细小特征，难以提供更深入的视角；而 DIA 图像的分辨率更高，能够精准辨识小特征，并放大细节，揭示照片中微小特征的更多信息。DIA 获取的图像是照片的数字化高清副本，能够进一步放大查看，从而获得更多深入的见解。

Orbitrap 非对称轨迹无损 (Astral) 分析仪于 2023 年发布，是一款利用 DIA 工作流程的功能强大的质谱仪器。与之前的 Orbitrap 仪器相比，它具有更快的速度、更高的灵敏度和分辨率，可以定量更多的肽。

DIA 和 DDA 之间的主要区别

为了说明 DIA 工作流程对发现蛋白质组学的影响，我们将 Orbitrap Astral 分析仪的性能与一系列前代仪器（包括 Q Exactive HF (QE)、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Lumos) 和 Orbitrap Ascend Tribrid (Ascend)）进行了比较，使用小鼠肝蛋白的胰岛消化物，主要色谱运行时间为 45 分钟。 

下表总结了两种不同方法获得的结果： 

这篇博文的其余部分将更详细地探讨 DDA 和 DIA 方法，并比较利用这两种技术进行实验所获得的数据数量和数据质量。

数据采集​​方法：DDA 与 DIA 中的肽碎片化

要了解 DDA 和 DIA 之间的区别，首先需要了解肽碎片化和数据采集的不同方法。 

在 DDA 方法中，质谱仪在全范围概览扫描和一系列窄范围扫描之间交替进行，全范围概览扫描用于测量在任何给定时刻从 LC 柱洗脱的所有肽，而窄范围扫描则会选择性地隔离一小部分共洗脱的肽。在肽采集后，根据全范围概览扫描中实时分析的共洗脱肽信号强度，对各个肽进行优先级排序，以决定其碎片化顺序。这个过程会在整个 LC 梯度长度内重复进行，目的是尽可能多地鉴定感兴趣的独特肽，从而最大化样本的覆盖度。

相反，DIA 方法利用新仪器的更高分辨率 (>10K)、更高的质量精度 (<10 ppm) 和更快的扫描速度，生成更高质量的数据，适用于几乎无限多重化的分析。与选择一部分肽进行碎片化不同，DIA 方法除了使用全范围概览扫描外，还采用更宽的隔离窗口，一次性捕获并碎片化多种共洗脱的肽。该过程在每个时间间隔内生成来自多个共洗脱肽的重组碎片化数据，从而实现样本蛋白组的全面覆盖。

图 1 显示了 DDA 与 DIA 方法的比较，说明了不同的隔离窗口及其对肽采集的影响。

图 1.DDA 与 DIA 蛋白质组学方法在肽碎片化中的比较示意图，具体包括：(A) 显示 LCMS 色谱图的示意图；(B) 在 30 分钟时完整共洗脱的胰蛋白酶肽的前体 MS1 概览扫描；以及 (C) 随后进行的碎片化扫描，展示 DDA 和 DIA 工作流程，DDA 使用窄隔离窗口选择一部分肽进行碎片化，而 DIA 则使用宽隔离窗口在每个时间间隔内对所有肽同时进行碎片化。

实验例子：DIA 与 DDA 的结果比较

如上所述，我们使用小鼠肝蛋白的胰蛋白酶消化物，在 45 分钟的液相色谱运行时间内，将 Orbitrap Astral 分析仪的性能与一系列前代仪器进行了比较。 

我们的研究结果总结如下。DIA 方法可鉴定的蛋白质组数量是 DDA 方法的三倍，同时表现出更高的灵敏度和更好的实验重现性。

定量分析的蛋白质组更多 

如图 2 所示，Orbitrap Astral 系统可鉴定出超过 10,000 个蛋白质组，而传统 DDA 方法只能鉴定出 2,500 - 3,600 个蛋白质组。

图 2. 与上一代 Orbitrap 仪器相比，使用 DIA 和 DDA 采集方法在 Astral 上鉴定的蛋白质组数量。

Orbitrap Astral 系统还支持运行 DDA 蛋白质组学工作流程。利用这种肽采集方法，该设备鉴定出了 6,600 个蛋白质组，但这一数量仍明显低于 DIA 方法的检测表现。

提高实验的可重复性

为了进一步说明 DIA 和 DDA 方法之间的差异，我们在 Orbitrap Astral 仪器上使用 DIA 和 DDA 方法分析了同一组小鼠肝脏样本。图 3 展示了两组样本中鉴定出的蛋白质组的热图，其中 DIA 方法提供了更完整的数据矩阵，缺失值更少。由于 DDA 工作流程在整个 LCMS 运行过程中对分析物进行随机采样，而且捕获的数据远少于 DIA，因此与 DIA 结果相比，其数据存在更多的空白区域（或空值）。

因此，与 DDA 方法（可重复性约 69%）相比，DIA 结果在重复样本之间（更少空白值）以及两种样本类型之间的可重复性明显更高（约 93%）。

图 3. 热图矩阵显示使用 Orbitrap Astral 仪器通过 DDA 或 DIA 方法对雌性和雄性小鼠肝脏 (n=3) 进行的蛋白质组分析。

提高低丰度蛋白质的灵敏度和鉴定能力

两组数据的比较表明，DIA 方法的灵敏度也明显高于 DDA 方法，定量测量结果增加了两倍以上，从而获得了更完整的数据矩阵（图 4）。由于数据矩阵中存在更多定量值（~45,000 个对比 ~20,000 个），因此可以将统计测试应用于更多数据点，从而实现更全面的分析，并具有更好的分析冗余和统计能力。

图 4. 数据集的条形图比较，显示定量测量数量增加了两倍以上。

下方的直方图显示了 DIA 和 DDA 方法中鉴定的蛋白质的分箱丰度测量值（图 5）。结果清楚地表明，与相同样本的 DDA 分析相比，DIA 方法能够从小鼠肝脏样本中鉴定和量化更多的低丰度蛋白质（0.1 到 3.1 之间）。通过 DIA 分析获得的蛋白质组覆盖深度的增加，体现在沿 x 轴的细长分布，增加幅度至少达到了一个数量级。

图 5. 比较了在不同丰度水平下从小鼠肝脏样本中鉴定出的蛋白质组（x 轴为在多个重复实验和样本中，对平均蛋白强度进行对数转换 (log₁₀) 后分箱处理的结果），并对比了 DDA（绿色）和 DIA（蓝色）工作流程的方法。

即使是低丰度蛋白质也能显著影响细胞健康，并且低丰度蛋白质组中可能存在潜在的疾病生物标记物。DIA 方法可以更全面地了解蛋白质表达，有助于发现 DDA 分析可能遗漏的药物靶点。

与 CST 的蛋白质组学服务团队合作

凭借 Orbitrap Astral 分析仪的先进 DIA 功能和极高的灵敏度，可以在各种领域的广泛蛋白质组学研究中实现深度覆盖，包括： 

• 作用机制研究
• 靶向和脱靶验证
• 发现疾病驱动因素
• 蛋白质生物标记物的发现和验证
• 蛋白质 PTM 生物标记物的发现和验证
• 监测细胞信号转导，包括乙酰化组和/或甲基化组信号转导
• 泛素化分析
• 针对蛋白质降解研究的验证
• 识别调节的信号转导通路

我们的蛋白质组学服务团队拥有超过 20 年的经验，可以为您的项目提供定制的实验设计和指导。我们还将与您合作，了解您的实验目标，并帮助确保结果有意义并推动您的发现研究工作。

联系我们，了解有关 CST 蛋白质组学分析服务的更多信息，以及如何利用这款尖端设备更高的灵敏度和可重复性来降低项目风险。

选择参考文献：

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