杂志俱乐部 | 二价核小体的基因组处理

在某种程度上，基因及其调节元件的活性受其细胞类型特异性染色质组织的控制。核小体是染色质的基本结构单位，以受控于促进或压制基因表达的许多翻译后修饰的组蛋白为核心缠绕而成。个别组蛋白同时携带活性和抑制性标记，并且偶尔同时带有这两种类型的修饰。这种双重或“组合”修饰在某些细胞群中普遍存在。

就现在的情况而言，没有一种可靠的方法可确定某个特殊基因组区域的某个个别核小体是否携带表明活性和抑制性染色质状态的组合标记。

在 2016 年 5 月 6 日的《科学》上，麻省总医院 (Massachusetts General Hospital) 和哈佛医学院 (Harvard Medical School) 的 Shema 和同事们报告了一种新方法，使用一种高通量荧光单分子方法来检测个别核小体的组蛋白修饰和基因组定位。该文章的标题为：“组合修饰核小体的单分子解码”。

染色质免疫沉淀法 (ChIP) 通常是研究与基因表达调控有关的组蛋白修饰的“通用”方法。虽然 ChIP 可检测某种指定染色质修饰的大致基因组位置，但无法提供检测核小体水平的表观遗传标记所需的分辨率。质谱法在这方面更敏感，但仅能检测在同一碎裂组蛋白肽上存在的修饰，且缺乏关于基因组位置的信息。

Shema 等设计了一种单分子方法来解决这些局限性，这种方法基于使用可检测特异性组蛋白修饰的偶联单克隆抗体来分离、固定，并通过全内折射 (TIRF) 显微镜观察单核小体。

1. 通过微球菌核酸酶消化来分离核小体
2. 将游离 DNA 的末端连接至荧光标记的生物素化接头蛋白寡核苷酸
3. 在涂有聚乙二醇 (PEG) 和链霉亲合素的玻片上捕获接头蛋白连接的荧光单核小体。
4. 使用 TIRF 显微镜观察单核小体，并记录它们在玻片上的位置，然后在接头蛋白分子上裂解荧光团。
5. 使用可检测特异性组蛋白修饰的荧光标记抗体对捕获到的单核小体进行孵育。
6. 使用延时 TIRF 显微镜监测重复的抗体结合和解离活动，以便对每种修饰的阳性和阴性核小体进行适当刻痕。
7. 进行单分子测序，以将组蛋白修饰对比至特定基因组位点。

原理验证：

使用单分子方法对人胚肾 (HEK) 293 细胞中的组蛋白 3 赖氨酸 9 (H3K9ac) 乙酰化的基础水平进行评估。对数百万个单独核小体进行监测时，发现所有核小体当中有 1% 携带这种修饰。正如预计的一样，当使用组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 抑制剂处理细胞时，该数字升至 7%。作为一种阴性对照，对未经修饰的重组核小体中的 H3K9ac 表达进行检测，且仅有 0.1% 的核小体刻痕为阳性。此外，还针对 H3K4me3、H3K27me3、H3K27me2 和 H3K27ac 标记对核小体进行刻痕。同样，在未经修饰的重组核小体上对这些修饰进行交叉检测，以确定实验的特异性。

主要发现

1. 二价核小体在多能性胚胎干细胞 (ESC) 中普遍存在。 

由于 ESC 中的核小体及其谱系定向核小体含有二价核小体，因此对它们进行刻痕。“二价”一词是指同时表达抑制性和活性组蛋白标记的染色质区域，通常分别对应 H3K27me3 和 H3K4me3 修饰。文献中的早期报道提出，这些对立修饰的共存在 ESC 的发育性基因启动子中较为明显，这是一种被认为可平衡这些基因以实现其他细胞系命运的特性。连续 ChIP 和 IP 质谱实验中有证据支持这种现象，而对于这种标记是否位于相同的核小体上并没有确切的证据。因此，在这项研究中，研究人员尝试运用其单分子方法来解决这个问题。

TIRF 成像显示，在调查的所有核小体中，大约有 6.5% 携带 H3K27me3、2% 携带 H3K4me3，仅 0.5% 同时携带两种标记。作者的结论是，后一个亚组是真正的二价。研究发现，正如预计的一样，这些核小体在分化的细胞中较为罕见。

此外，监测到各种不同的修饰组合，包括标记活性增强子 (H3K27ac) 的修饰和分别结合抑制和激活 H3K27me3 和 H3K4me3 标记的基因间区 (H3K27me2)。结果发现，ESC 和谱系定向细胞（肺成纤维细胞）的染色质显示出与两种活性标记 H3K4me3 和 H3K27ac 明显的两两结合。但只有 ESC 显示出二价染色质，作者推测这可能与 ESC 染色质的高动力性有关。

2. 二价核小体在某些癌细胞中普遍存在：

之前已表明，在 ESC 中携带二价染色质的基因组位点经常在癌细胞中出现不当调控。考虑到这一点，Shema 等筛选了包括淋巴瘤细胞系 Karpas 422 在内的多个癌细胞系。Karpas 422 在 EZH2 基因中携带一种功能获得性突变，这会增强该蛋白的催化活性，造成 H3K27 三甲基化水平升高。在 Karpas422 细胞中发现 50% 携带 H3K4me3 的核小体也会在 H3K27me3 被修饰。作者估计，二价核小体的比例比这两种标记预期的随机或人工重叠要高四倍，表明 EZH2 是含有 H3K4me3 的优先甲基化核小体。为了进一步测试，作者使用 EZH2 抑制剂处理 Karpas 422，以监测二价核小体的频率。结果，他们在这些细胞中观察到二价核小体的优先耗竭，进一步验证了他们的单分子方法。

3. 染色质调制剂对组合组蛋白标记频率的影响：

在带有 H3K4me3 活性标记的核小体中，用 pan-HDAC 抑制剂进行处理会优先增加 H3K9ac 和 H3K27ac 的乙酰化水平，这与激活启动子组蛋白乙酰化的功能一致。p300 组蛋白乙酰转移酶抑制剂会无偏差地降低 H3K4me3 核小体的乙酰化水平，这与这种酶在增强子元件而非启动子区域的作用一致。

4. 二价核小体的 DNA 基因组图绘制：

最后但同样重要的是，该研究利用了一种由 Harris 等在 2008 年首次报道的单分子 DNA 测序方法，这种方法可用来进行测序并将与每个个别核小体有关的 DNA 对比至基因组内的某个特殊位点。如上所述，这通过使用 TIRF 显微镜在 ESC 中解码每个核小体的修饰状态来实现，然后通过酶消化取代组蛋白，留下双链核小体 DNA。

单分子测序法使用一种 DNA 聚合酶、一个 poly(A) 加尾模板库以及 Poly(dT) 寡核苷酸，它们被用于捕获模板，并随后被用作模板定向短读数合成的一个引物。从这次测序工作中产生的 H3K27me3 阳性核小体相对应的 26,000 个读数与在 ChIP 测序 (ChIP-seq) 中检测结果为 H3K27me3 阳性的基因组区域进行交叉参照。结果发现，这些读数中几乎有 50% 与在 ChIP-seq 中检测到 H3K27me3 标记的基因组区域相吻合。检测到了大约 1000 个读数，它们对应于含双重 H3K27me3 和 H3K4me3 标记的核小体，这些标记可比对至 Runx1 和 Nkd1 等发育基因，这首次为个别二价核小体的基因组位置提供了确切的证据。

结论：

总之，该研究利用蛋白质组学和基因组方法加深了我们对单分子分辨率下的染色质组织的理解。

虽然这项研究中的许多发现不一定是新发现，在这些发现中，所描述的观察结果在以前的报告中就推测和假设过，但 Shema 和同事们提出了一种以高通量、可扩展的方式来验证这些推测的强大方法，并且只需要最少的输入材料。

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CST 资源：

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