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使用经 CUT&RUN 验证的抗体提高您的实验成功率

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使用经 CUT&RUN 验证的抗体提高您的实验成功率

CUT&RUN 提供染色质免疫沉淀法 (ChIP) 或 ChIP-seq 的强大功能,从细胞检测到 DNA 检测只需一到两天,并且可使用少至 5000 到 20000 的细胞。与任何基于抗体的技术一样,识别兼容的抗体是确保检测成功的关键部分。CUT&RUN 是一种相对较新的技术,限制了应用中经过验证的抗体数量。因此,一些公司建议使用经 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体进行 CUT&RUN 检测,因为所有三种技术都用于分析细胞和组织中基因组中的蛋白质-DNA 相互作用。

我们知道,您可能想知道所有经过 ChIP 验证的抗体是否能在 CUT&RUN 检测中真正起作用?事实上,我们发现情况并非如此。让我们来探究一下原因。

为什么经过 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体可能不适用于 CUT&RUN 检测

尽管两种测定法都用于分析染色质,但在影响抗体识别的方法上可能存在显著差异(表 1)。

 

ChIP

CUT&RUN

样品制备

用甲醛和裂解细胞交联染色质。

将细胞与 Concanavalin A 包被的磁珠结合,并用洋地黄皂苷渗透细胞膜。

染色质富集

使用对 DNA 结合蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体进行体外免疫沉淀。

对 DNA 结合蛋白、辅因子或组蛋白修饰具有特异性的抗体在细胞膜透化后进入细胞核的体内富集。

染色质碎裂

在染色质免疫沉淀之前,使用 MNase 进行非靶向酶解法或使用超声法机械剪切染色质。

基于一抗与 pAG-MNase 的相互作用,在富集过程中进行靶向酶解法。

染色质/蛋白质状态

含有部分变性的组蛋白和 DNA 结合蛋白的碎片化染色质。

具有天然构象的组蛋白和 DNA 结合蛋白的连续染色质。

表 1:ChIP 和 CUT&RUN 方法。 

并非所有经 ChIP 和 ChIP-seq 验证的抗体都在 CUT&RUN 检测中发挥作用

我们测试了超过 100 种(并且还在增加!)靶标蛋白的抗体,发现只有 50-60% 的 ChIP-或 ChIP-seq 抗体与 CUT&RUN 检测兼容。使用 SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 进行 ChIP 实验,而使用 CUT&RUN Assay Kit #86652DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209 进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP Universal qPCR Master Mix #88989 进行下游定量聚合酶链反应 (qPCR) 分析,并使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) #47538进行 DNA 库制备。使用 Illumina NextSeq 平台进行 NG-seq 分析。

当检测经 ChIP 验证的 Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb #14994 和经 ChIP 和 ChIP-seq 验证的 Stat1 (D4Y6Z) Rabbit mAb #14995 时,两种抗体均显示出在 ChIP 中靶标基因的稳健富集(图 1A)。Stat1 #14994 没有为 ChIP-seq 生成可通过的数据,但它确实在 CUT&RUN 检测中显示了富集。另一方面,经过 ChIP 和 ChIP-seq 验证的 Stat1 #14995 不适用于 CUT&RUN 检测,因为没有观察到已知目标 STAT1 靶标基因 IRF1 或 AIM2 的富集(图 1B)。

22-ETC-39681 C&R 2.0 Blog_Social Fig1图 1. 对经过 Human Interferon-γ (hIFN-γ) 处理的 HT-1080 细胞进行 ChIP 和 CUT&RUN 实验。虽然两种 STAT1 兔单克隆抗体在 ChIP (A) 检测中都显示出靶标基因的强大富集,但只有 Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb #14994 在 CUT&RUN (B) 检测中显示出靶标基因富集。请注意,虽然 Stat1(D4Y6Z) Rabbit mAb #14995 已经过验证,并且在 ChIP-seq 中显示靶标基因富集,但它不适用于 CUT&RUN (B) 检测。

还测试了三种 Stat3 抗体:经 ChIP 和 ChIP-seq 验证的 Stat3 (124H6) Mouse mAb #9139Stat3 (79D7) Rabbit mAb #4904。同样,所有三种抗体都使用 ChIP 稳健地富集了靶标基因(图 2A),但只有 Stat3 #9139 证明了使用 CUT&RUN 的稳健靶标基因富集(图 2B)。Stat3 #12640 在 CUT&RUN 检测中确实显示出一些靶标基因富集,但最终因为观察到低基因组信噪比,因而不符合 Cell Signaling Technology (CST) 验证标准。

22-ETC-39681 C&R 2.0 Blog_Social Fig2图 2. 对饥饿过夜且经过 IL-60 处理的 HepG2 细胞进行 ChIP 和 CUT&RUN 实验。虽然所有三种 STAT3 单克隆抗体在 ChIP (A) 中都显示出稳健的靶标基因富集,但只有 Stat3 (124H6) Mouse mAb #9139 在 CUT&RUN (B) 检测中显示出稳健的靶标基因富集。请注意,虽然经 ChIP-seq 验证的 Stat3 (D3Z2G) Rabbit mAb #12640 确实在 CUT&RUN (B) 检测中显示了靶标基因的富集,但由于高背景信号而未能通过验证。

 

抗体

经过 ChIP 验证

经过 ChIP-seq 验证

适用于 CUT&RUN 检测

Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb #14994

Yes

Yes

Stat1 (D4Y6Z) Rabbit mAb #14995

Yes

Yes

Stat3 (124H6) Mouse mAb #9139

Yes

Yes

Stat3 (79D7) Rabbit mAb #4904

Yes

Stat3 (D3Z2G) Rabbit mAb #12640

Yes

Yes

表 2:通过 CUT&RUN 测定法测试的所述抗体的总结。

正如这两个示例所示,仅依靠抗体经过 ChIP 或 ChIP-seq 验证这一事实,并不一定能保证 CUT&RUN 检测成功。因此,最好的办法是使用经过 CST CUT&RUN 验证的抗体来确保成功。但是,如果尚未确定 CUT&RUN 验证的抗体,您可以从 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体开始。请注意,您可能需要筛选不同的抗体才能找到一种有效的抗体。

为了节省您自己测试抗体的时间和金钱,CST 正在积极为您验证 CUT&RUN 抗体!

CST 如何验证 CUT&RUN 抗体

CST 以拥有严格的验证标准而闻名,以确保抗体适用于您的应用,在验证 CUT&RUN 抗体时也不例外。为了提供经证实在 CUT&RUN 检测中有效的抗体,我们使用 CUT&RUN Assay Kit #86652、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209、SimpleChIP Universal qPCR Master Mix #8898、DNA Library Prep Kit for Illumina #56795(ChIP-seq, CUT&RUN)和 Multiplex Oligos for Illumna(Dual Index Primers)#47538 检测全部抗体。

抗体必须满足以下所有标准才有资格成为经 CUTRUN 验证的抗体:

  1. 抗体敏感性:将目标富集信噪比与输入控制进行比较。与要通过的输入染色质相比,抗体必须提供一个可接受的最低明确富集峰数,以及一个最小的信噪比。
  2. 抗体特异性
    - 将来自敲除型细胞系的信号与野生型细胞进行比较。如果敲除型细胞不可用,请使用针对不同靶标蛋白表位的多种抗体,在整个基因组中寻找一致的富集峰分布。
     - 使用针对多蛋白复合物中不同亚基的抗体寻找一致的富集峰分布。
    - 使用针对给定靶标蛋白的额外抗体,将整个基因组的富集与已发布的 CUT&RUN 和 ChIP-seq 数据(即 ENCODE)进行比较。
    - 使用定性 PCR (qPCR) 分析已知阳性和阴性靶标基因座的富集。与已知阴性靶标基因座相比,抗体必须显示已知阳性基因座的最小富集倍数。它还必须显示由靶标特异性抗体与同型对照抗体对已知靶标基因座的富集水平决定的最小信噪比。
  3. 序列特异性 DNA 结合转录因子的抗体特异性:对富集的染色质片段进行转录因子结合基序分析。

使用 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体进行 CUT&RUN 并不能自动确保成功,因为其中只有 50-60% 是兼容的。在您自己花时间筛选抗体之前,请务必查看我们不断增长的经 CST 验证的 CUT&RUN 抗体列表。您也许可以节省宝贵的时间!

其他资源:

  • 没有看到针对您的目的靶标的经验证抗体?请联系技术支持,因为我们可能正在测试您的目的抗体。
  • 需要更多信息?查看 CUT&RUN 资源中心,您可以在那里找到经验证的抗体、实验步骤和 DNA 库制备视频、疑难问题解答指南和常见问题解答列表。
  • 详细了解我们的抗体验证原则
CST 和 Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标或注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问 cellsignal.com/trademark 以了解更多信息。
Chris F
Chris F
Christopher Fry 是 Cell Signaling Technology 的表观遗传学、检测和工作流程解决方案的高级总监。他是一名在威斯康星大学和 UMASS 医学中心接受培训的表观遗传学科学家。在 CST,他正在帮助开发和管理表观遗传学产品组合,特别关注开发抗体和基于抗体的工具来研究疾病的表观遗传机制。

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