脑多重分析：无限可能

人大脑平均包含超过 1000 亿个细胞，这几乎与银河系的恒星数相同，真是一个天文数字！这些脑细胞共同驱动我们思考、记忆、感受情绪和与世界互动的能力。这些细胞真正造就了我们自身。脑的主要细胞是神经元，它是一种高度极化的细胞，具有分子特异性树状分支结构，它能启动和驱动信息传递并最终驱动脑功能。然而，其他的非神经元细胞（包括少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞）在维持适当的神经元功能方面发挥作用，即便不起到关键作用。它们还在发育和疾病中发挥至关重要的作用。

对这些脑细胞类型染色不仅对识别脑细胞结构至关重要，而且对识别特定的脑细胞也至关重要。多重技术和探针使神经科学家能够在一次实验中同时测量多个分子靶标。该技术有助于在网络或组织中对单个细胞进行分子分析，从而提供细胞功能的快照。 

为何选择多重分析?

大脑中的细胞包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。这些细胞具有独特的分子特征。您可能熟悉其中一些细胞特征，包括 NeuN（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）、髓鞘碱性蛋白和 Olig2（少突胶质细胞）以及 Iba1（巨噬细胞/小胶质细胞）。检测这些分子特征的探针可以包括使用原位杂交等技术检测转录本的互补 RNA 探针。尽管基于抗体的方法可能缺乏基于 RNA 的方法所具有的一些敏感性和特异性，但使用抗体检测蛋白质具有多种优势。例如，基于抗体的蛋白质检测可以揭示特定蛋白质的定位，从而表明特定的功能。例如，星形胶质细胞蛋白 GFAP 是一种揭示星形胶质细胞形态的细胞骨架蛋白。在神经元中，NeuN 定位于细胞核，正如预期的转录因子那样。通过用 MAP2 和 NFL 等抗体进行染色，可以分别标记树突和轴突，从而揭示高度树枝化的神经元。更深入地研究亚细胞蛋白质，特别是神经元中的亚细胞蛋白质，可以揭示有关细胞结构/功能的更多见解。

许多不同类型的蛋白质参与突触（神经元进行通讯的中心单元）的形成、维持和可塑性。蛋白质可能包括细胞粘附分子、接头蛋白和支架蛋白。突触蛋白，例如突触素和 PSD95（分别是突触前和突触后蛋白），在神经元突触中富集。利用多重分析技术，研究人员可以检查他们最喜欢的蛋白质与已知突触蛋白的共定位。例如，他们的目的蛋白与突触后蛋白（如 PSD95）的共定位可以表明突触后功能。

多重分析方法

研究人员使用多种方法来有效地进行多重分析染色实验。最简单的多重分析方法之一使用源自各种宿主的一抗和同种型（兔 IgG、小鼠 IgG1、大鼠 IgG2a 等），然后使用对宿主一抗特异的荧光团偶联二抗探测。另一种方法是将一抗与特定的荧光团或酶直接接合。通常，抗体不太适合这种方法 — 例如，可用的抗体来自相同的宿主物种，或者它们没有与适当的检测方式接合。为了解决这个问题，研究人员可以使用 TSA 剥离实验步骤，该实验步骤涉及用荧光团偶联的酪胺进行连续的标记和剥离。所有这些方法都有其优缺点。然而，大脑特别敏感且复杂，检测低丰度目标可能很困难。更加复杂的方法正在出现。例如，与传统方法相比，DNA 寡核苷酸标记抗体随后进行信号放大，可以同时对远超过 3-4 种蛋白质进行染色。

使用多重分析法研究阿尔茨海默病

多重分析技术的发展和持续演变与神经科学中出现的重要研究问题相吻合，特别是在阿尔茨海默病等领域。阿尔茨海默病的病理特征之一是淀粉样斑块，这与临床行为病理学和神经病理学相关。 最近，非神经元细胞在该神经退行性疾病的病理学中的作用受到了深入研究。这项工作的大部分是由单细胞 RNAseq 等新技术推动的，该技术允许在单细胞水平上进行转录组分析。因此，该领域最近才开始认识到小胶质细胞的分子多样性。

小胶质细胞是脑的常驻巨噬细胞，被动员起来侦测并清除碎片，包括受损的神经元和斑块。在正常和患病条件下对这些细胞的分析揭示了不同的转录组学特征，表明不同的小胶质细胞在疾病进展中起着关键作用。^1,2

尽管转录组分析揭示了大脑中存在的小胶质细胞的复杂性，但蛋白质是细胞的功能货币。该领域当前的挑战是使用多重分析技术来研究疾病背景下的特定小胶质细胞。例如，研究人员报告了与疾病相关的不同转录组特征，即所谓的疾病相关小胶质细胞 (DAM)。¹ GPNMB 是一种编码糖蛋白的基因，可作为炎症的负调节剂，在 AD 小鼠模型中高度上调。研究人员使用抗体染色 GPNMB，可以在其他脑细胞和疾病病理的背景下探测小胶质细胞表达的 GPNMB。在图 1 中，小胶质细胞表达的 GPNMB 蛋白（黄色）包围淀粉样斑块（蓝色），表明该蛋白质在疾病进展中起直接作用。正如转录组学数据所表明的那样，这些小胶质细胞是不同的 DAM，仅仅是 GPNMB 分期的 IBA1 阳性小胶质细胞的一个子集。在组织和疾病的背景下通过蛋白质组学特征识别 DAM 使研究人员能够了解小胶质细胞在疾病进展中可能发挥的独特作用。

对阿尔茨海默病的淀粉样蛋白小鼠模型的脑组织进行共聚焦免疫荧光分析。使用 Iba1/AIF-1 (E4O4W) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（红色）、HS1 (D5A9) XP^® Rabbit mAb (Rodent Specific) (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)（绿色）、GPNMB (E7U1Z) Rabbit mAb（黄色）和 methoxy XO4（蓝色）标记切片。图片由 Marco Colonna 博士实验室（华盛顿大学）的 Simone Briochi 博士友情提供，并经许可使用。

随着新技术的发展，使用基于抗体或转录本的多重探针的染色技术对于了解复杂过程和疾病的分子和细胞机制将变得越来越重要。在大脑中，仍然存在一些挑战。例如，在老年人的大脑中观察到大量自发荧光，这使得基于荧光的检查变得复杂。扩增方法，例如基于寡核苷酸的 PCR，可以提高信噪比，从而使该组织的分析更容易。目前，大多数研究人员使用劳动密集型流程将组织切成薄片，以便于探针穿透和成像。然而，全组织透明技术和光片荧光显微镜等先进的成像技术将极大地促进多尺度染色和成像。这些进步将极大地提高人们理解脑科学中仍然存在的无数问题的能力。

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选择参考文献：

1. Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A, et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 2017;169(7):1276-1290.e17. doi:10.1016/j.cell.2017.05.018
2. Mathys H, Davila-Velderrain J, Peng Z, et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease [published correction appears in Nature. 2019 Jun 17;:]. Nature. 2019;570(7761):332-337. doi:10.1038/s41586-019-1195-2