人大脑平均包含超过 1000 亿个细胞，这几乎与银河系的恒星数相同，真是一个天文数字！这些脑细胞共同驱动我们思考、记忆、感受情绪和与世界互动的能力。这些细胞真正造就了我们自身。脑的主要细胞是神经元，它是一种高度极化的细胞，具有分子特异性树状分支结构，它能启动和驱动信息传递并最终驱动脑功能。然而，其他的非神经元细胞（包括少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞）在维持适当的神经元功能方面发挥作用，即便不起到关键作用。它们还在发育和疾病中发挥至关重要的作用。
对这些脑细胞类型染色不仅对识别脑细胞结构至关重要，而且对识别特定的脑细胞也至关重要。多路复用技术和探针使神经科学家们在单次实验中同时测量多个分子靶标成为可能。这项技术促进了在网络或组织环境中对个体细胞的分子概况进行分析，从而快速了解细胞功能。
为何选择多重分析?
脑中细胞包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。这些细胞具有独特的分子特征。您可能熟悉这些细胞特征的某一些，包括 NeuN（神经元）、GFAP（星形细胞）、 髓鞘碱性蛋白&Olig2（少突胶质细胞）和Iba1（巨噬细胞/小胶质细胞）。检测这些分子特征的探针可包括互补性 RNA 探针，这类探针使用诸如原位杂交的技术检测转录物。虽然基于抗体的方法可能缺乏基于 RNA 的方法所试图达到的某种灵敏度和特异性，但是使用抗体检测蛋白质具有若干优点。例如，基于抗体的蛋白质检测可以显示特定蛋白质的定位，提示特定功能。例如，星形胶质细胞蛋白 GFAP 是显示星形胶质细胞形态的细胞骨架蛋白。在神经元中，NeuN 定位于细胞核，如对转录因子所预期的那样。使用 MAP2 和 NFL 等抗体染色，通过分别标记树突和轴突，揭示高度树状化的神经元。更深入地研究亚细胞蛋白质（特别在神经元中）可以额外洞悉细胞的结构/功能。
许多不同类型的蛋白质参与突触的形成、维持和可塑性，突触是神经元籍此交流的中心单元。蛋白质可包括细胞粘附分子、接头蛋白和支架蛋白。突触蛋白如 突触小泡蛋白 和 PSD95 （分别为突触前蛋白和突触后蛋白）在神经元突触富集。使用多重分析技术，研究人员可以检查其感兴趣的蛋白质与已知突触蛋白的共同定位。例如，目的蛋白与突触后蛋白（如 PSD95）的共定位可能提示突触后功能。
多重分析方法
研究人员使用多种方法有效地多路复用染色实验。最简单的多路复用方法之一是使用源自各种宿主物种的一抗和同种型（兔 IgG、小鼠 IgG1、大鼠 IgG2a 等），并使用对所用宿主一抗特异的荧光团偶联二抗。另一种方法是将一抗直接与特异性荧光基团或酶偶联。抗体往往不完全适合这种方法，例如，可用的抗体来自相同的宿主物种，或者它们不与适当的检测模式耦合。为了解决这个问题，研究人员可以使用 TSA 洗脱方案，该方案涉及使用荧光团偶联的酪胺进行连续几轮标记和剥离。 所有这些方法都有其优缺点。然而，脑可能具有独特的敏感性和复杂性，并且可能难以检测低丰度靶标。更复杂的方法正在涌现。例如，与更传统的方法相比，具有后续信号放大的 DNA 寡核苷酸标记抗体能够同时进行远超 3-4 种蛋白质的蛋白质染色。
使用多重分析法研究阿尔茨海默病
多重分析技术的发展和持续演进与神经科学中、尤其阿尔茨海默病等领域浮现的重要研究问题相吻合。 阿尔茨海默病的病理标志之一是淀粉样斑块，这些斑块与临床行为病理学以及神经元病理学相关。最近，非神经元细胞在这种神经退行性疾病中的病理学作用已得到深入研究。这项工作的大部分内容由多种新技术推动，比如单细胞 RNAseq，它能在单细胞水平进行转录组学分析。于是，该领域仅最近才开始了解小胶质细胞的分子多样性。
小胶质细胞是脑的常驻巨噬细胞，被动员起来侦测并清除碎片，包括受损的神经元和斑块。通过分析正常和疾病条件下的这些细胞，提示其转录组学特征存在不同，这表明特定的小胶质细胞在疾病进展中正起着关键作用1,2。
虽然转录组学分析已揭示了脑内存在的小胶质细胞复杂性，但蛋白是细胞的功能体现者。该领域当前面临的一项挑战是使用多路复用技术在疾病背景下研究特定小胶质细胞。例如，研究人员报告了与疾病相关的不同转录组学特征，即所谓的疾病相关小胶质细胞 (DAM)1。在 AD 小鼠模型中，GPNMB 显著上调，这种基因编码一种充当炎症负向调节分子的糖蛋白。使用抗体对 GPNMB 蛋白染色后，研究人员可以在其他脑细胞和疾病病理学的背景下探测小胶质细胞表达的 GPNMB 蛋白。在图 1 中，小胶质细胞表达的 GPNMB 蛋白（黄色）包围淀粉样斑块（蓝色），表明该蛋白质在疾病进展中发挥直接作用。正如转录组学数据提示，这些小胶质细胞是不同的 DAM，因为仅 IBA1-阳性小胶质细胞亚群体展示出 GPNMB。依据组织和疾病背景下的蛋白质组学谱辨识 DAM，使研究人员能够了解小胶质细胞在疾病进展中可能发挥的独特作用。
随着新技术演进，使用基于抗体或基于转录物的多重分析探针的染色技术对于了解复杂过程和疾病的分子与细胞机制将变得日益重要。对于脑研究，仍存在数个挑战。例如，在衰老的人脑中观察到大量自发荧光，从而使基于荧光的检查更为复杂。扩增方法，例如基于寡核苷酸的 PCR，可以提高信噪比，从而可以更容易地分析这种组织。目前，大多数研究人员通过耗时费力的步骤将组织切成薄切片，以促进探针穿透并成像。然而，全组织透明化技术和正在发展的成像技术（如光片荧光显微镜）将极大促进多尺度染色和成像。这些进步将极大促进理解脑科学中已有的无数谜题。
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对阿尔茨海默病的淀粉样蛋白小鼠模型的脑进行共聚焦免疫荧光分析。使用 Iba1/AIF-1 (E4O4W) XP®Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) （红色）、HS1 (D5A9) XP® Rabbit mAb (Rodent Specific) (Alexa Fluor® 488 Conjugate)（绿色）、GPNMB (E7U1Z) Rabbit mAb （黄色）和 methoxy XO4 (Blue)（蓝色）标记切片。图片由华盛顿大学 Marco Colonna 博士实验室 Simone Briochi 博士友情提供，并经许可使用。
参考文献：
1) Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A ddengdengredengren 等人, A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 2017;169(7):1276-1290.e17. doi:10.1016/j.cell.2017.05.018
2) Mathys H, Davila-Velderrain J, Peng Z 等人, Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease [published correction appears in Nature. 2019 Jun 17;:]. Nature. 2019;570(7761):332-337. doi:10.1038/s41586-019-1195-2
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