使用偶联抗体成功进行多重免疫荧光实验的策略

使用免疫荧光 (IF) 分析工作的好处之一是能够比较单一样品内部的多个蛋白表达模式。有数种采用 IF 进行多重分析的方法。

间接检测：基于宿主的免疫荧光多重分析

目前，最流行的方法是基于宿主的多重分析。在这种场景中，每种抗体都有一个独特的宿主物种，这个宿主物种允许用偶联于荧光团的宿主特异性二抗独立检测每种抗体。此方法也称间接检测法。

使用染料偶联的一抗进行直接检测

另一种 IF 多重分析方法是使用染料偶联的一抗进行操作。这种方法称为直接检测法。直接检测法有几个缺点。首先，实验设计不太灵活，因为您一直在处理抗体的光谱要求。另外，与使用间接检测法相比，偶联物倾向于更暗淡。这归因于如下事实：偶联物受其标记有多少个荧光团限制，而偶联于荧光团的多种二抗可利用间接检测法检测一抗。

虽然直接检测法有诸多缺点，但也有好处，因为这种方法比基于宿主的间接检测法更快。初学者也更易操作直接检测法，因为只需一个抗体结合步骤就产生信号。再者，这些缺点正在减少。人们越来越有兴趣使用寡核苷酸偶联的抗体，这类抗体可以大幅增加多重分析维度和检测灵敏度。遗憾的是，这种方法不如使用染料偶联抗体操作那样快。

IF 多重分析的顺序标记策略

第三种 IF 方法涉及某种顺序标记策略。这可能是通过顺序轮次的一抗标记、酪胺-链霉亲和素 (TSA) 检测和抗体破坏（这在多重 IHC 中常见）进行。或者，它可能涉及顺序轮次的偶联物标记、成像和从抗体切下染料（典型的循环性 IF 实验步骤）。

由于工作流程更简单、更快，故人们可能倾向于只使用偶联物操作；但在一些情况下，间接检测法可能有益。在检查低丰度靶标时，您可能需要通过间接检测法提供更明亮的信号。可能存在这样一种抗体，该抗体不以偶联形式提供，或不可用于偶联至您实验所需的染料。在这种情况下，可能将基于宿主的检测法与采用染料偶联一抗的染色法结合。这种方法的最简明形式就是配合偶联物使用独特宿主并且不纳入能够检测偶联抗体的二抗。

在 CST，我们的许多抗体源于兔。我们已发现，使用相同宿主的两种（或更多种）抗体进行多重分析是一种有用的技巧。这种方法依赖于将染料偶联的一抗与宿主同偶联一抗的一种非偶联抗体相结合。

步骤如下：

1. 将样品在 4°C 下与所有非偶联一抗按建议的浓度孵育过夜。
2. 将样品在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 中洗涤三次。
3. 使用相应的荧光团偶联二抗检测一抗。
4. 在 1X PBS 中洗涤样品三次。
5. 在室温下，用过量的适当宿主（初级浓度的 10 倍）非偶联的免疫球蛋白阻断游离的二级结合位点 1 小时。我们已验证 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP Isotype Control #3900 和 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 均可用于此目的。
6. 在 1X PBS 中洗涤样品三次。
7. 将样品在 4° C 下与荧光团偶联抗体按建议的浓度孵育过夜。
8. 在 1X PBS 中洗涤样品三次。

该技术依赖于在添加偶联抗体之前用宿主免疫球蛋白阻断游离的结合位点。我们已使用兔抗体（Olfm4 一抗 ＋ PCNA 647 偶联物）和小鼠抗体（APP/β-淀粉样一抗 ＋ GFAP 647 偶联物）成功进行了这种方法，细节如下。

使用兔抗体进行 IF 多重分析：

使用 Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific) #39141（黄色）对小鼠小肠进行共聚焦免疫荧光分析。使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 阻断游离的二抗结合位点后，随后使用 PCNA (D3H8P) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #82968（洋红色）和 Non-phospho (Active) β-Catenin (Ser45) (D2U8Y) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #70034（青色）标记组织。用 DAPI #4083（灰色）着染细胞核。将小肠组织横切面以 20X（左图）裁切，以展示增殖细胞核抗原 (PCNA) 存在于正增殖的隐窝细胞（右图）中。

使用小鼠抗体进行 IF 多重分析：

对过量表达突变型人 APP695 的小鼠 Tg2576 脑组织进行共聚焦免疫荧光分析。首先用 HS1 (D5A9) XP^® Rabbit mAb (Rodent Specific) #3892（绿色）和 APP/β-Amyloid (NAB228) Mouse mAb #2450（黄色）标记切片。使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 阻断游离的二抗结合位点后，用 GFAP (GA5) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #3657（红色）孵育切片。用 Hoechst 33342 #4082（蓝色）标记细胞核。

祝您实验顺利，愉快地使用多重分析！

仍有选择多重 IF 实验用抗体方面的问题？请联系 CST 技术支持部寻求科学专家的建议。