成功免疫荧光法四部曲系列第三部分。阅读第 1 部分：验证的重要性和第 2 部分：实验控制。
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抗体的性能是获得可靠免疫荧光 (IF) 结果的一个重要决定因素。同样重要的是，在加入任何抗体之前，制备生物样品 — 在您的实验中使用的细胞或组织。样品固定和通透是决定实验成败的关键步骤。理想的固定剂可以保留“栩栩如生”的样品效果，同时还会通过交联和抑制内源酶快速阻止自溶降解过程。
在抗体开发中，CST (Cell Signaling Technology) 科学家测试了不同的方法，为你提供最适合每种抗体的建议固定和通透实验步骤，因此，你无需猜测。
这篇帖子提供了有关使用不同实验步骤时不同抗体会如何发挥最佳性能的例子。
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基于醛的固定剂如甲醛、福尔马林（一种溶解的甲醛与较低百分比甲醇的混合物）和戊二醛使用最广泛。对于大多数抗体，CST 建议使用 4% 甲醛固定，您可以在我们的采用甲醛固定的免疫荧光实验步骤中了解更多信息。醛类会与细胞蛋白发生反应和交联，从而固化样品，并使之变得稳定。相比醇类，醛类更能穿透质膜并固定可溶性蛋白，但某些靶标可能会在醛交联中丢失自身的抗原性。
其他资源：请访问我们的实验步骤页面，以查看 CST 为各种应用推荐的固定和透化方法。
脱水/变性固定剂（如甲醇）替换细胞大分子周围的水，从而导致细胞大分子原位变性和沉淀。靶标蛋白变性可能会让通常隐藏的表位暴露出来，因此这种方法对某些抗体而言具有优势。但脱水固定剂不太适用于可溶性靶标及修饰状态特异性抗体，如磷酸化抗体。参见产品数据表，以了解最佳固定法。
横向比较使用不同固定实验步骤固定的 HeLa 细胞，表明 Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546 配合甲醇固定法效果最好。相反，AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 配合甲醛固定法效果最好。
使用 Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546（绿色，上行）或 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318（绿色，下行）对经甲醛（左图）或甲醇（右图）固定的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。红色 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。
如果您正在使用需要不同 CST 实验步骤（标准免疫荧光法与免疫荧光法甲醇固定或免疫荧光法甲醇透化）的抗体进行多重分析，您可能需要优先确定哪种抗体按其最佳条件使用。在扩大您的实验前，进行一次小型测试以比较不同实验步骤可能获得一些信息。
如果使用交联固定剂，则质膜将仍保持完整，这会使胞内靶标无法接触抗体。因此，应在交联固定之后进行通透，除非你的抗体能检测胞外表位。在我们的免疫荧光标准实验步骤中，使用封闭步骤固定后（参见下一部分），并入 Triton X-100 透化法。Triton 和其他去垢剂（如 NP-40、TWEEN、皂素、洋地黄皂苷和 DOTMAC）从细胞膜移除不同分子，并且形成大小不一的“孔”让抗体进入。
或者，也可在固定步骤之后，使用乙醇或甲醇进行醇类通透。这种方法结合了：交联固定剂的快速固定与中间物变性。这可以增强某些靶标的信号，尤其是与细胞器或细胞骨架相关的靶标。如下所示，甲醇透化法提升某些抗体的性能。
PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501 和 ß-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700 配合甲醇透化法效果最好。使用 #3501（绿色）和 #3700（红色）对经 0.3% Triton® X-100（左图）或甲醇（右图）通透的 NIH/3T3 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色假色 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
同固定一样，最佳通透方法也根据所使用的抗体来调整确定。请参见我们产品数据表中的推荐方法，或如有疑问，请联系 CST。
如需了解更多 IF 染色技巧，请下载我们全面的免疫荧光成功指南，其中包含这篇帖子中提及的所有实验步骤以及更多有用的提示，如下所示：
你是否曾想过，我们是如何提出我们建议的抗体稀释度的？阅读本系列最后一篇博文第 4 部分：抗体稀释度和孵育条件的。
有关成功实现免疫荧光的更多提示，请查看以下博客：
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