成功免疫荧光法四部曲系列第 1 部分。阅读第 2 部分：实验对照、第 3 部分：固定和透化以及第 4 部分：抗体稀释度和孵育条件。
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经过数月的努力工作，你的研究已集中在一个你可以用免疫荧光 (IF) 法验证的假设。但你现在必须作出一个选择。你如何决定使用哪种抗体来获得可靠的免疫荧光结果？你如何知道图像是否准确报告了靶标的位置？在这篇帖子中，我们探讨了一些注意事项。
验证特异性以免误导性免疫荧光结果
一抗是免疫荧光实验的一种关键组分，其性能会直接影响数据质量。在蛋白印迹 (WB) 实验中检测到一个特异性条带，并不足以保证所选的抗体也在免疫荧光实验中有效。在蛋白印迹分析中，会将蛋白放在会改变蛋白结构的苛刻还原/变性条件下，因此蛋白印迹实验中抗体检测到的表位可能会在免疫荧光实验中被隐藏或无法检测到，因为在这样的实验中，蛋白仍保留其天然状态。
在我们的免疫荧光资源中心更多了解 CST 如何验证用于免疫荧光的抗体。
为了说明为什么免疫荧光特异性验证对确保结果准确至关重要，我们测试了一种针对免疫荧光已验证的 CST® 抗体对比另一家供应商的已验证抗体，后者已上市用于免疫荧光应用，但仅在蛋白质印迹法中验证过。
α-突触核蛋白抗体的免疫荧光验证
α-突触核蛋白在脑细胞中高表达，其功能异常会导致神经退行性疾病，如帕金森病。在健康组织中，α-突触核蛋白预计位于突触前末梢，在此它与突触囊泡缔合。
CST 科学家将 α-Synuclein (D37A6) XP® Rabbit mAb #4179 与另一家公司的 α-突触核蛋白抗体横向比较，抗体各自按制造商建议的稀释度使用，两种抗体在蛋白质印迹法中均表现如预期（图 1，左图）。在免疫荧光（图 1，右图）中，中脑切片内对 #4179 观察到与 α-突触核蛋白突触前定位一致的点状染色；而另一家公司的抗体则显示不太呈点状的样式，并且至关重要地，它错误报告在胞核或胞体内定位。
图 1. “清晰”蛋白印迹并不能充分确保抗体在免疫荧光分析中也有良好性能和可靠性。左侧：使用 α-Synuclein (D37A6) XP® Rabbit mAb #4179 或另一家公司的 α-突触核蛋白抗体对来自小鼠脑和大鼠脑的提取物进行蛋白质印迹分析。右侧：使用 #4179（上行）或另一家公司的抗体（下行）对小鼠中脑下部切片和海马体切片进行共聚焦免疫荧光分析。以白色箭头注明经另一家公司的抗体错误标记为 α-突触核蛋白的神经元胞体/胞核。
这项实验说明了应用特定验证的重要性。
成功免疫荧光法实验的最佳做法
阅读成功免疫荧光法系列的其余部分，包括讨论免疫荧光对照的设计、固定和透化注意事项以及抗体孵育条件的博文：
- 第 1 部分：成功的免疫荧光法：验证的重要性
- 第 2 部分：成功免疫荧光法：实验对照
- 第 3 部分：成功免疫荧光法：固定和透化
- 第 4 部分：成功免疫荧光法：抗体稀释度和孵育条件
您也可以跟随以下链接，下载“成功免疫荧光法指南”，一份满含成功免疫荧光实验小提示及其 9 步实验步骤。
其他资源：
有关成功实现免疫荧光的更多提示，请查看以下博客：
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