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成功的免疫荧光法:实验对照

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成功免疫荧光法四部曲系列第二部分。阅读第 1 部分:验证的重要性第 3 部分:实验对照第 4 部分:抗体稀释度和孵育条件

经过数月的努力工作,你的研究已集中在一个你可以用免疫荧光 (IF) 法验证的假设。您已选择抗体,已进行免疫荧光法预实验(参见第 1 部分:“验证的重要性”),并且蛋白定位显得合理。

但你如何确定你获得的免疫荧光数据就能代表真正的生物现象呢?我们在这篇帖子中介绍了两个实验对照例子。

免疫荧光法的实验对照

并入合适的对照对确认样品间唯一变化是否在实验变量范围内及试剂包括抗体是否如预期一样起作用至关重要。此类对照可能包括药物学处理、添加调控信号转导通路胞外的配体或比较存在差异性基因表达(敲除、siRNA 等)的细胞。通常,变量和对照是并行的,这样就能同时进行固定步骤和后续处理。使用的对照类型取决于实验类型。

在以下部分中,我们提供了我公司科学家在免疫荧实验中用于评估抗体能的对照示例,您可能想要并入这些对照中的某些,以确认您的细胞类型的特异性。

使用敲除型细胞系来验证靶标特异性

如果你正在研究某种有多个同工型的靶标,那么可以使用敲除型细胞系作为对照可能有用。比如,GSK-3α 和 GSK-3ß 两种基因会编码糖原合成酶激酶 (GSK-3),它们在不同丝氨酸残基被调控。进行免疫荧光实验时,你可能想知道你正在使用的抗体是否能检测一种或两种同工型,还是都不能检测。

这可以使用已知呈目的靶标表达阳性或阴性的细胞来确认。使用野生型(GSK-3ß 阳性)、GSK-3α 敲除型(GSK-3ß 阳性)和 GSK-3ß 敲除型(GSK-3ß 阴性)小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 证明,GSK-3ß (D5C5Z) XP Rabbit mAb #12456 在免疫荧实验中特异性识别正确的同工型。 

GSK-3B 蛋白质印迹分析和免疫荧光分析

如蛋白质印迹分析和免疫荧分析所展示,GSK-3ß (D5C5Z) XP Rabbit mAb #12456 对 GSK-3ß 特异。左侧:使用 #12456(上图)和 GSK-3α/ß (D75D3) XP Rabbit mAb #5676(下图)对来自野生型、GSK-3α (-/-) 和 GSK-3ß (-/-) MEF 的提取物进行蛋白质印迹分析。右侧:使用 #12456(绿色)对野生型 MEF(左图)、GSK-3α (-/-) MEF(中图)和 GSK-3ß (-/-) MEF(右图)进行免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 DyLight 554 Phalloidin #13054 标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(荧光 DNA 染料)。

通过调节靶标磷酸化状态来确认磷酸化特异性

对磷酸化、乙酰化、泛素化、剪切等翻译后修饰 (PTM) 具有特异性的抗体可揭示有关靶蛋白生物功能的重要信息。在某些情况下,PTM 变化可能与表达和/或定位变化相吻合。为此,可以使用 PTM 特异性抗体联合酶性或化学激动剂和/或抑制剂调节靶蛋白的激活状态确认细胞中的 PTM 变化。

实验扰动分析确认某抗体的 PTM 特异性

实验扰动分析确认某抗体的 PTM 特异性。使用 Phospho-Cyclin D1 (Thr286) (D29B3) XP Rabbit mAb #3300(绿色)对未经处理(左图)或单用蛋白酶 MG-132 处理(中图)或经 MG-132 处理后再经 λ-磷酸酶处理(右图)的 HT-1080 细胞进行共聚焦免疫荧分析。肌动蛋白丝用 DyLight 554 Phalloidin #13054 标记。

成功免疫荧光法实验的最佳做法

下载“成功免疫荧光法指南”,一份满含成功免疫荧光实验小提示及 9 步实验步骤的资源。

下载指南

 

其他资源:

有关成功实现免疫荧光的更多提示,请查看以下博客:

阅读完整的成功免疫荧光法系列: 

Kenneth Buck, PhD
Kenneth Buck, PhD
作为一名受过训练的细胞生物学家,Ken 在罗格斯大学获得了博士学位,并继续在耶鲁大学担任博士后研究员,在那里他研究了再生神经元细胞运动所涉及的细胞骨架动力学和信号转导机制。在 CST,Ken 与科学家合作创建多媒体科学通信。当他不写视频脚本或不在工作室时,可以观察到他在自然栖息地,在马萨诸塞州多岩石的北岸与同事一起骑山地自行车。

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