成功的免疫荧光法：抗体稀释度和孵育条件

这是成功免疫荧光法四部曲系列的第四部分。阅读第 1 部分：验证的重要性、第 2 部分：固定和透化和第 3 部分：实验对照。

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在制备好您的样品之后，立即使用经过充分验证的抗体（免疫荧光实验的重要工具）进行孵育。如果您在免疫荧光实验方面是经验丰富的行家，那么您可能会习惯性地查看抗体数据表（或网页）来了解建议的稀释度。但你有没有想过这些建议从何而来？

一抗滴定

常规情况下，CST 科学家使用阳性和阴性细胞系进行滴定，以便为你提供既能产生最佳信号又能最大程度减少背景染色的建议稀释度。通过比较表达目的靶标的细胞中荧光强度的“信号”——阳性平均荧光强度 MFI(+)——与缺乏表达的细胞的背景噪声——阴性平均荧光强度 MFI(-)——可以计算出信噪比 (S/N)。 

以下展示了一个使用针对 Mucin-1 (MUC-1) 的抗体进行抗体滴定的例子，红色部分为最佳浓度/建议稀释度。表达 Mucin-1 的 ZR-75-1 细胞如上排所示，不表达 Mucin-1 的 HCT 116 细胞如下排所示。最佳抗体稀释度（红色部分）在 ZR-75-1 细胞中产生高信号，但在 HCT 116 细胞中并未显示太多背景（换而言之噪音）。 

优化用于进行免疫荧光分析的 MUC1 (D9O8K) XP Rabbit mAb #14161 的稀释比例。使用指定稀释度下的 #14161（绿色）对 ZR-75-1 细胞（MUC1 阳性，上图）和 HCT 116 细胞（MUC-1 阴性，下图）进行免疫荧光分析。红色 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。

ZR-75-1 细胞的 MFI(+)、HCT 116 细胞的 MFI(-) 以及用 MFI(+) 除以 MFI(-) 计算得出的 S/N 均绘制在下图中：

分析 MUC1 (D9O8K) XP® Rabbit mAb #14161 稀释度的 S/N。对表达型（MFI(+)，橙色）ZR-75-1 细胞和非表达型（MFI(-)，蓝色）HCT 116 细胞中的平均荧光强度定量以及计算得出的 S/N（绿色）。

如果使用的抗体浓度过低，荧光信号将会太暗以致无法与背景噪声进行区分。另一方面，浓度过高会导致背景染色，从而使 S/N 下降。始终查看产品数据表，以了解建议的稀释度。

[视频] 下次免疫荧光分析前要问的三个问题

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一抗孵育条件：时间和温度

我们建议的所有一抗稀释比度均基于 4°C 孵育过夜。这并不一定意味着 CST 抗体在自动化平台通常使用的较短孵育期内就无效。可增加一抗浓度来补偿较短的孵育时间，但这会增加成本。

温度是另一个要考虑的变量。下面的实验说明了信号强度对孵育时间和温度的依赖性。

SNB19 间叶细胞表达中间纤丝蛋白波形蛋白，但不表达黏附蛋白上皮钙粘素，而 HT-29 上皮细胞则表达上皮钙粘素，但不表达波形蛋白。使用 Vimentin (D21H3) XP Rabbit mAb #5741 和 E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb #3195 对两种细胞系进行分析，每种抗体均在建议的稀释比例、变化的温度和一抗孵育时长下使用。

Imentin (D21H3) XP Rabbit mAb #5741 在波形蛋白阳性 SNB-19 细胞中的信号强度检测表明，在建议的 4°C 过夜 (O/N) 孵育条件下，信号水平最佳，而在更高温度更短时间下的孵育所产生的信号明显更弱。用相同抗体孵育过夜的波形蛋白阴性 HT-29 细胞如图所示，可供比较。

使用 Vimentin (D21H3) XP^® Rabbit mAb #5741（白色）对波形蛋白阳性细胞系 SNB-19 和波形蛋白阴性细胞系 HT-29 进行共聚焦免疫荧光分析。将一抗按其建议稀释度在 4°C、21°C 或 37°C 下孵育 1 小时、2 小时或过夜 (O/N)。CST 建议的一抗孵育条件 (4°C O/N) 产生的信号最强、背景最低（红框内）。蓝色= Hoechst 33342 #4082（DNA 荧光染料）。

使用一个高通量激光扫描细胞成像仪对 Vimentin (D21H3) XP Rabbit mAb #5741 在波形蛋白阳性细胞中的信号水平进行定量，结果表明在过夜孵育的情况下 MFI(+) 增加（左下图）。对于 1 小时或 2 小时孵育，温度升高与 MFI(+) 和 S/N 升高相关，但相关性不如过夜孵育。

对于 E-cadherin (24E10) Rabbit mAb #3195，在 4ºC 或 21ºC 孵育过夜的情况下，MFI(+) 和 S/N 都升高（右下图），但没有 #5741 那么明显。有趣的是，孵育过夜的情况下，温度升高 (37ºC) 实际上会导致 MFI(+) 和 S/N 降低，这可能是由于表位缺失和/或抗体结合。使用波形蛋白抗体时未观察到这种现象，这可能是因为波形蛋白中间纤丝更稳定。尽管使用 #3195 时，在更高温度下观察到的 S/N 最高，但在 4ºC 孵育过夜的情况下 MFI(+) 接近最佳，且 S/N 较为合理。

并不是每种抗体都对变动温度和孵育时长产生相同反应。对于有意向采用更短孵育时间的科学家（例如对许多样品进行高通量分析），进行这种优化可获得更多信息。在缩短孵育时间或改变温度时，应谨慎考虑靶标丰度和抗体稳定性。 

成功免疫荧光法实验的最佳做法

感谢查看“成功进行免疫荧光实验”的帖子。如需了解更多信息，请使用以下链接下载“免疫荧光法成功指南”，一份满含成功免疫荧光实验小提示及 9 步实验步骤的资源。

其他资源：

有关成功实现免疫荧光的更多提示，请查看以下博客：

• 获得发表级免疫荧光图片的 5 个步骤
• 在开始你的免疫荧光实验前要问的 3 个问题
• 使用多种抗体进行荧光染色

阅读完整的成功免疫荧光法系列： 

• 第 1 部分：成功免疫荧光法：验证的重要性
• 第 2 部分：成功免疫荧光法：实验对照
• 第 3 部分：成功免疫荧光法：固定和透化
• 第 4 部分：成功的免疫荧光法：抗体稀释和孵育条件