高通量免疫测定中使用经过验证的抗体对的重要性

多年来， ELISA 从原始方法衍生出许多改进和变体，包括用于比色、化学发光或荧光测量的酶偶联物和底物。为了简化方法和提高免疫测定的灵敏度，还开发了许多仪器。然而，即使有了新的免疫测定技术和方法，所有这些技术的基础仍然是抗体对，其特异性和灵敏度最终决定了测定性能。

抗体特异性在免疫测定中的重要性

抗体的特异性不仅确保我们测量的是我们想要测量的内容，而且还通过影响背景信号/噪声来提高灵敏度。如果我们考虑与表面结合的抗体，预结合信号或来自该抗体本身的信号可能非常低。一旦将样品添加到检测中，即在血浆或细胞裂解物中，就会有感兴趣的靶标加上数以千计的可能与单克隆抗体 (mAb) 结合的可能靶标。样品中发生的非特异性结合越大，分析的基线或噪音就越高。有一些统计和实验方法可以将基线保持在较低水平，但没有先天 mAb 特异性，此基线可能过高，这将限制检测的灵敏度。

抗体特异性提高信噪比

一种抗体的特异性可以与第二种抗体的特异性结合，以构建“mAb-target-mAb”夹心结构（其中一个抗体是捕获，一个抗体是检测）。尽管拥有两个 mAb 可能会使噪音增加两倍，但利大于弊。在不列出所有可能性的情况下，一般特征是通过拥有两种单克隆抗体，您可以提高您的特异性，并且可以偶联一种或两种 mAb 以协助表面捕获或检测。

针对任何平台开发高质量的测定法

通常优先使用两种配对抗体进行免疫测定。然而，总体的问题是，这种方法将成功的门槛提高了一倍多。

首先，需要努力寻找两种特定的单克隆抗体，而不是一种。另一个问题是抗体必须同时结合两个不同暴露的表位，同时还结合到表面或偶联到检测部分。必须使用大量资源、时间和金钱来寻找单独测试的 mAb，然后成对测试和验证以满足这些标准。

靶标蛋白的测量是至关重要的——构建测量所需的工具通常不是核心问题。您将花费大量资源来开发此工具。人们通常更喜欢用温度计来测量体温，而不必先制作温度计。

那么，如何构建一个不受平台限制的高通量免疫分析呢？

从特定的、稳定的单克隆抗体开始。越多越好。然后在一个简单的检测中找出哪些抗体对，并确定哪些抗体对在偶联时仍然有效。古老的格言“您得到您筛选的东西”在这里适用。如果您筛选适用于 IHC 的单克隆抗体，它也可能适用于 ELISA 格式。但是，专为 ELISA 应用设计的筛选会为该测定法产生更好的单克隆抗体。

考虑到使用抗体对的众多平台，它是否适合所有研究？在一天结束时，您将不得不在您选择的特定平台上尝试抗体对或抗体对组合。然而，无论平台如何，具有特定表位特异性的单克隆抗体都将检测到相同的表位。平台之间最大的差异之一是可能需要针对特定表面、珠子或检测方法偶联单克隆抗体。如果该抗体对的早期验证的一部分涉及测试单克隆抗体的偶联形式，无论其结构如何，那么抗体在所选平台上也能发挥作用的可能性要高得多。

无论采用何种技术，对任何免疫分析最重要的部分是，筛选和验证高特异性和敏感的抗体来组成抗体对。

Cell Signaling Technology 验证标准

Cell Signaling Technology 检测开发团队在筛选众多抗体组合时采用相同的验证标准，以找到用于我们 ELISA 试剂盒的最佳抗体对。

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